大豆轮作及秸秆还田模式对白菜根肿病的影响

魏兰芳，张荣琴，姚 博，张晋豪，熊新颖，代真林，艾 瑛，姬广海*

（1.云南农业大学 农科基础实验教学中心，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201；3.云南省玉溪市通海县植保植检站，云南 玉溪 652700）

【研究意义】芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae) 能够引起十字花科作物根肿病，已成为全球十字花科作物中最严重的病害之一，根肿病菌能够危害100 多种十字花科作物[1]。【前人研究进展】该病于1737 年首次被发现，作为一种土传病害，根肿病的病原菌在土壤中的存活时间能达到8 年之久[2]，休眠孢子在无感病寄主植物的土壤中甚至可以存活10 年以上[3]。芸薹根肿菌生活史存在3 个阶段，即休眠孢子时期、根毛侵染期和皮层侵染期[4-6]。由根肿病在世界范围内每年造成产量损失10%～15%[7]。在发病较重田块实行与非十字花科作物轮作3 年以上，可有效降低病害的发病率[8]。在发病较轻的田块合理安排茬口，避免与十字花科作物连作，以削减田间病原菌的积累，躲避易感作物，阻断侵染路径[9]。十字花科作物与小麦、玉米、大豆等非十字花科作物轮作，可避免病菌在田间持续滋生和积聚[10]。句梦娜等[11-12]研究表明西兰花轮作及残体还田对马铃薯和棉花黄萎病有很好的防治效果。张蕾等[13]用大豆作为前茬作物来控制油菜根肿病，结果表明前作大豆，后茬油菜对油菜根肿病的发病率和病情指数都会显著降低。【本研究切入点】近年来，根肿病持续扩散，在我国的华北、华南、东南、西南地区均有发生，常年发生面积约320 万～400 万hm2，占十字花科作物种植面积的1/3 以上，严重降低白菜产量和品质，制约白菜产业的发展，造成巨大的经济损失[14]。由于根肿病危害严重且难以防治，根肿病的防治研究显得尤为重要和迫切。化学防治是目前最主要的防治手段，但过度使用化学药剂又会产生3R (抗药性、再猖獗和农药残留)问题，能够造成环境污染，引起人畜中毒等严重后果。根肿病在生产上会导致十字花科蔬菜的产量严重下降，甚至绝收，尤其连茬种植加重病情的恶化，也极大地制约了油料和蔬菜产业的农业可持续稳定发展。因此亟需探索一条新的根肿病绿色防控思路，寻找安全且高效地防治十字花科蔬菜根肿病的新途径。目前，为了能够有效地减少化学农药大量施用，人们也在不断探索新的农作物多样性栽培模式和措施，其中轮作模式控制土传病害成为了近几年关注的热点。【拟解决的关键问题】本试验对大豆轮作（白菜-大豆-白菜）及大豆秸秆还田控制白菜根肿病的效果进行评价并分析防治机理，进一步研究了大豆根瘤菌作为生防菌剂防治根肿病的潜能，探索能够高效、稳定防治十字花科蔬菜根肿病的生态种植技术和综合防治措施，为云南省十字花科蔬菜绿色可持续发展提供安全有效的理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验材料 带菌土壤和根肿病组织：采自云南省昆明市白菜根肿病重病田（发病率为100%，病情指数为77.43）；白菜根肿组织，存放于-20 ℃冰箱备用。供试植株：白菜品种：感病品种83-1（鲁春白1号，青岛国际种苗有限公司）。大豆品种：日本3号。白菜、大豆种植：育苗盆高25 cm，内口径29 cm；带菌病土，草木灰，珍珠岩按4∶1∶1混合拌匀。育苗盆内种植10株白菜或者5株大豆。

1.1.2 主要培养基及试剂 NA 培养基（营养琼脂培养基）：蔗糖10 g，蛋白胨5 g，牛肉膏3 g，酵母浸膏1 g，琼脂粉20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，pH 7.0，121 ℃湿热灭菌20 min 后制成培养平板。YEM 培养基：甘露醇10 g、酵母膏3 g、氯化钠0.2 g，硫酸镁0.2 g，磷酸氢二钾0.5 g，琼脂17～20 g，加水溶解后定容至1 000 mL，pH 7.2，121 ℃湿热灭菌20 min后制成培养平板。化学杀菌剂：氰霜唑（有效成分含量100 g/L，宁波石原金牛农业科技有限公司）。

1.1.3 试验地点 云南农业大学植物保护学院温室。

1.2 研究方法

1.2.1 轮作大豆及大豆秸秆还田试验设置 白菜根肿病病土种植大豆一季，大豆收获后轮作种植白菜，白菜连作作为对照处理，同时设置一组大豆-白菜轮作+大豆秸秆还田处理（表1）。每个实验处理设置3 个生物重复。

表1 不同种植模式实验设计Tab.1 Different planting patterns experimental design

1.2.2 防效测定 白菜播种50 d后调查根肿病的发病率和病情指数，并计算出相对防效。

病情等级参照如表2。利用Excel 2007和DPS7.5软件进行数据分析。

表2 白菜根肿病病情分级标准Tab.2 Chinese cabbage clubroot disease condition classification standard

1.2.3 土壤样品根肿菌荧光定量PCR 检测（1）根际土壤收集。白菜根际土壤采集参照Cui 等[15]的方法，每个处理的5 株白菜（“Z”字5 点采样）根际土收集混合为1 个样品，每个处理2 个重复。土壤样品收集于50 mL 离心管并置于冰盒中，尽快带回实验室后保存于-80 ℃冰箱。（2）土壤DNA 和根肿菌孢子DNA。提取根肿菌孢子DNA 提取参照吴发红等[16]构建的方法。采集试验前后根际土壤样品进行根肿菌荧光定量PCR 检测，使用土壤DNA 提取试剂盒（Cas12888，QIAGEN，Germany），进行土壤中根肿菌基因组DNA 的提取。Nano Drop2000 超微量分光光度计检测DNA 浓度和纯度，置于-20 ℃冰箱备用。（3）PCR 扩增及其重组质粒的制备。利用实验室前期依据根肿病菌核糖体RNA 18S-ITS 基因，筛选得到特异性较强的根肿菌特异性引物PB05F/R（PB05F：GAACGGGTTCACAGACTAGAT；PB05R：GCCCACTGTGTTAATGATCC）[17]，目的片段大小为158 bp，对提取的土壤中根肿病菌基因组DNA 进行普通PCR 扩增，PCR 反应总体系为25 µL，10×PCR Buffer（含Mg+）2.5 µL，dNTP 2 µL，rTaqDNA 聚合酶（5 U/µL）0.5 µL，PCRPrimer（10 µmol/L）各1 µL，DNA 2 µL，ddH2O（灭菌）16 µL。PCR 扩增条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，51 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，72 ℃补充延伸10 min，35 个循环。12 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物。PCR 产物用普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（DP209，天根生化科技有限公司，北京）纯化回收目的片段。目的片段纯化后连接到克隆载体pMD19-T（6013，TAKARA，大连），转化至E.coliJM109 感受态细胞，过夜培养进行蓝白班筛选，挑取阳性克隆，送昆明擎科生物技术有限公司测序验证。（4）重组质粒标准品的制备。测定重组质粒标样品的吸光度，使用无菌水为参照，计算重组质粒的浓度。将重组质粒样品按10 倍梯度稀释，稀释8 个梯度作为模板，利用SYBR Greenn（FP205，天根生化科技有限公司，北京）荧光染料法进行实时荧光定量PCR，以重组质粒DNA 浓度为x 轴，Ct值为y 轴，建立根肿病菌的qPCR 标准曲线，计算回归方程。实时荧光定量PCR 反应总体系为10 µL（表2-3），反应程序在QuantStudio TM 7 Flex（Applied Biosystems，USA）荧光定量PCR 仪上进行，扩增条件为95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 个循环。在每个循环的延伸阶段（51 ℃）同步采集荧光。PCR 扩增结束后进行溶解曲线分析，以验证扩增的特异性。荧光定量PCR 反应总体系为10 µL，SYBR Green Master Mix 5 µL，PCR引物（10 µmol/L）各1 µL，DNA 1 µL，ddH2O（灭菌）2 µL。（5）土壤样品中根肿病菌的qPCR 检测。提取的土壤总DNA 为模板，通过qPCR 检测根肿病菌（每个样品取3 次重复，检测结果取平均值），根据Ct 值计算出土壤中根肿菌孢子的含量。

1.2.4 土壤根际微生物群落多样性分析 白菜根际土壤样品送至北京百迈客生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 测序技术迚行高通量测序。测序初始数据（raw data）为FASTQ 格式，选Trimmomatic 软件对原始的双端序列进行去杂处理后利用FLAS 软件进行序列拼接，同时利用usearch 检测并去除序列中的嵌合体序列获得优质序列。采用Vsearch 软件，根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（operational taxonomic units）。参数为序列相似度大于或等于97%被归为一个OTU 单元。使用QIIME 软件包的挑选出各个OTU的代表序列，并将所有代表序列与数据库进行比对注释。16S利用Greengenes或者Silva（ver‑sion123）数据库比对。物种比对注释使用RDP classifier 软件，保留置信区间大于0.7 的注释结果。基于OTU的分析，明确样品之间的细菌和真菌群落结构、物种组成差异。

1.2.5 根瘤菌对白菜根肿病的影响（1）根瘤菌的分离、培养及其分子生物学鉴定。参照高亚梅等[18-19]大豆根瘤菌的分离方法，选根部饱满幼嫩根瘤，清洗干净后用体积分数75%的酒精表面消毒5 min，再用灭菌蒸馏水清洗3 次后用灭菌吸水纸吸干水分，研碎后放于装有45 mL 无菌水的三角瓶（容量100 mL）中，160 r/min 26 ℃振荡15 min 后取出静置5 min，取上清液梯度稀释成10 倍梯度稀释，将10-4、10-5、10-6稀释液各取100 µL 在YEM、NA 培养基上依次按低浓度至高浓度进行涂布分离。将平板倒置在28 ℃恒温培养箱培养48 h，后挑取具根瘤菌特征的菌落纯化培养两代后保存备用。提取根瘤菌菌株基因组DNA。釆用细菌通用引物27F 和1492R 进行PCR 扩增，基因组DNA 为扩增模板，引物序列为：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)/1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT)。PCR 反应体系为：EasyTaqPCR SuperMix 12 µL，27F/1492R 引物（10 µmol/L)各1 µL，DNA 模板（约50 ng/µg)1 µL，灭菌ddH2O 10 µL。PCR 扩增程序为：95 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，72 ℃10 min，35 个循环；扩增产物1.2%的琼脂糖凝胶电泳，送上海生工生物工程有限公司进行测序。将得到的16S rDNA序列在GenBank 数据库BLAST 中比对分析。（2）根瘤菌菌株的发酵培养。取保存于-20 ℃冰箱中的根瘤菌菌株悬浮液100 µL，接种到YEM 培养基上，（28±1）℃培养箱中培养3～4 d，通过平板划线将其接种于YEM 平板上，置于生化培养箱中28 ℃下培养至长出单菌落。将培养好的单菌落接到500 mL YEB 液体培养基的三角瓶中制成菌悬液，在（28±1）℃，160 r/min 条件下摇48 h 左右，测OD600值为0.5以上，得到的悬浊液即为发酵液。（3）根肿菌接种体的制备。取新鲜根肿组织洗净、体积分数75%酒精消毒后用破壁机搅碎，8 层纱布过滤，弃去残渣，将滤液装入50 mL 的灭菌离心管内，先2 000 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀用蒸馏水悬浮后再4 000 r/min 离心10 min，2 次重复。弃去上清液，用蒸馏水悬浮沉淀物，用血球计数板计数法将悬浮液的孢子浓度调至1×107/mL-1，4 ℃保存备用。（4）温室测定根瘤菌对白菜根肿病的生防效果。

播种后10 d将制备好的根肿病休眠孢子悬浮液（浓度为1×107/mL-1）灌根接种到种好的白菜上，每株苗接根肿病菌液为10 mL，24 h后接种根瘤菌菌悬液（浓度为3×108CFU/mL），每株苗根瘤菌用量为10 mL，于7 d和14 d后灌2次根瘤菌菌悬液。播种后50 d左右进行调查，记录根肿病的发病等级及植株的生理指标，利用Excel 2007和DPS 7.5数据处理软件整理数据并分析结果。

2 结果与分析

2.1 轮作大豆对白菜根肿病的控制效果

白菜播种后50 d 进行病害调查，每个重复采集10 株白菜，每个处理调查30 株，调查结果见表3。结果表明：在空白对照（BCBT）发病率达93.34%的情况下，大豆轮作后（RBSHL 和RBSHJ）均能降低白菜根肿病的发病率和病情指数；大豆轮作（RBSHL）后白菜根肿病发病率70.00%，病情指数40.00，防治效果为43.67%；大豆轮作后大豆秸秆还田（RBSHJ）处理对根肿病的发病率66.66%，病情指数33.33，防治效果为52.59%，比单一大豆轮作高出8.92%。由此说明轮作大豆对减轻白菜根肿病的发病率发挥着作用。

表3 轮作大豆对白菜根肿病的控制效果Tab.3 Control effect of soybean-cabbage rotation on clubroot disease

2.2 土壤样品中根肿菌荧光定量PCR检测

2.2.1 土壤中根肿菌标准曲线的建立 利用根肿菌特异性引物对PB05F/PB05R，以人工配制的病土获得的根肿病菌孢子DNA 为模板，扩增18S-ITS 基因，并通过连接转化至大肠杆菌DH5ɑ 后提取质粒制备重组质粒。重组质粒进行10 倍梯度稀释，以通过SYBR GreenⅠ荧光染料法进行荧光定量PCR，建立土壤根肿病孢子和Ct值之间的标准曲线。土壤根肿病孢子（x）与对应的Ct值（y）之间有良好的线性关系，回归方程为y=-3.245x+41.579，相关系数R2为0.981 6（图1）。

图1 荧光定量PCR土壤根肿菌标准曲线Fig.1 Standard curve of fluorescence quantitative PCR for soil rhizobia

2.2.2 轮作大豆土壤样品根肿菌荧光定量PCR 检测 利用荧光定量PCR 对不同处理后土壤样品中的根肿菌进行荧光定量检测结果表明，轮作大豆和轮作大豆完秸秆返田处理后，每克土壤所含根肿病孢子数量由＞1×105.24个减少到1×104.45个和1×104.60个，约减少了77%（表4）。结合前期实验室的评估，土壤中孢子数含量＞1×105为病害发生高风险等级按照发病风险等级，处理后下降为中度风验等级，病害风险显著下降。

表4 白菜-大豆轮作根肿菌检测结果Tab.4 Results of detection of resting spores of P.brassicae in soybean and cabbage rotation

2.3 大豆与白菜轮作后白菜根际土壤微生物群落

2.3.1 白菜根际土壤微生物的多样性分析 物种多样性（diversity）指标：Chao1、Ace、Shannon、Simpson。Chao1和Ace指数衡量物种丰度即物种数量的多少，Shannon指数衡量物种多样性，Shannon指数值越大，多样性越高[20]。与连作模式相比，大豆轮作后根际土壤中细菌的OTU 数，Ace，Chao1 和Shannon 指数均显著增加，分别增加6.85 倍，4.15 倍，5.45 倍和2.43 倍，可以看出大豆白菜的轮作模式增加了根际土壤细菌的多样性。但从真菌的多样性分析，与白菜连作模式相比，大豆/白菜轮作后的白菜根际土壤真菌的多样性指数无显著差异（表5）。

表5 不同栽培模式下白菜根际土壤微生物多样性指数Tab.5 Chinese cabbage under different cultivation mode rhizosphere soil microbial diversity index

2.3.2 白菜根际土壤微生物目水平群落结构分析 对细菌、真菌群落结构进行分析，以物种分布柱状图展示（图2），一种颜色代表一个物种，色块长度表示物种所占相对丰度比例，并将其他物种合并为Others，Unclassified代表未得到分类学注释的物种。

从图2 中可以看出白菜根际土壤细菌群落在目分类水平上包含假单胞菌目（Pseudomonadales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、SBR1031、芽孢杆菌目（Bacillales）、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、β-变形菌目（Betaproteobacteriales）、Uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、芽单胞菌目（Gemmatimonadales）、梭菌目（Clostridiales）（图2a）。其中白菜连作（即未轮作大豆）模式下土壤根际微生物的优势菌主要为假单胞菌（Pseudomonadales），疣微菌目（Verrucomicrobiales）和芽孢杆菌目（Bacillales），丰度最高的假单胞菌目Pseudomonadales 在细菌群落中所占比例大于30%；轮作大豆后，根际微生物中的群落结构发生了转换，假单胞菌目（Pseudomonadales）、芽孢杆菌目（Bacillales）和梭菌目（Clostridiales）的相对丰度显著下降，尤其是假单胞菌目（Pseudomonadales）的在细菌群落中相对丰度小于1%（图2）；大豆轮作后白菜根际土壤菌群中根瘤菌目（Rhizobiales）、SBR1031、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、β-变形菌目（Beta‑proteobacteriales）、芽单胞菌目（Gemmatimonadales）的相对丰度显著增加。大豆轮作并大豆秸秆还田白菜根际土壤RBSHJ 中的根瘤菌目（Rhizobiales）在细菌群落中的相对丰度较大豆白菜轮作根际土壤RB‑SHL 中提高6%，这暗示大豆秸秆还田后增加了根瘤菌目的相对丰度。值得注意的是，大豆轮作后，其他菌群门（Others）在细菌群落中的比例显著提高，可以推测大豆轮作后根际微生物的细菌群落结构的多样性更加高。

根际土壤真菌群落在门分类水平上的优势菌群包括粪壳菌目（Sordariales）、肉座菌目（Hypocreales）、被孢霉目（Mortierellales）、散囊菌目（Eurotiales）、伞菌目（Agaricales）、格孢腔菌目（Pleosporales）、银耳目（Tremellales）、小丛壳目（Glomerellales）、酵母菌目（Saccharomycetales）和间座壳菌目（Coniochaetales）白菜连作和大豆白菜间作（包括秸秆还田）模式下，白菜根际土壤真菌的群落结构变化不大，大豆白菜轮作后肉座菌目（Hypocreales）的相对丰度显著下降，间座壳菌目（Coniochaetales）和被孢霉目（Mortierellales）的相对丰度显著增加，被孢霉目的丰度随着大豆轮作和轮作加秸秆还田的模式逐渐升高。

图2 不同栽培模式下土壤样品细菌和真菌在目水平的相对丰度Fig.2 Relative abundances of the dominate bacterial and fungi at Order levels under different cultivation patterns

2.3.3 白菜根际土壤微生物属水平群落结构分析 白菜连作（BCBT），大豆白菜轮作（RBSHL）和大豆/白菜轮作后大豆秸秆还田（RBSHJ）的属水平相对丰度较高细菌分别为14个属，22个属和26个属。不同栽培模式下种水平细菌的群落结构（图3a），通过分析连作模式下白菜根际土壤微生物的主要优势菌属为：假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）和阿克曼菌属（Akkermansia）。而大豆白菜轮作栽培模式下，白菜根际土壤微生物的优势物种为：鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、本土原生A4b 菌属、阿克曼菌属（Akkermansia）、Saccharimonas、芽单胞菌属（Gemmatimonas）。

白菜连作（BCBT），大豆白菜轮作（RBSHL）和大豆白菜轮作后大豆秸秆还田（RBSHJ）的真菌群落中优势菌属的数量增多，白菜连作根际土壤真菌的优势菌属（相对丰度＞1%）14个，大豆轮作和大豆轮作并秸秆还田后根际土壤的真菌优势菌属分别变为了42 个和26 个，大豆轮作后优势真菌菌属的数量增多。不同栽培模式下属水平真菌的群落结构（图3b），白菜连作栽培和大豆轮作栽培后的优势菌群基本相似，主要为：小被孢霉属（Mortierella）、大孢圆孢霉属（Staphylotrichum）、青霉菌属（Penicillium）、锥盖伞属（Conocybe）、镰刀菌属（Fusarium）、曲霉菌属（Aspergillus）、Saitozyma和裂壳属（Schizothecium），其中大豆白菜轮作后小被孢霉属的丰度显著增加。值得注意的是毛葡孢属（Botryotrichu）和尾孢菌属（Cercophora）在大豆轮作并秸秆还田后白菜根际土壤中的丰度显著增加。

图3 不同栽培模式下土壤样品细菌和真菌在属水平的相对丰度Fig.3 Relative abundances of the dominate bacterial and fungi at Genus levels under different cultivation patterns.

2.4 根瘤菌在大豆/白菜轮作中起重要作用

高通量测序结果分析可知，大豆白菜轮作后，根瘤菌的丰度增加。通过温室盆栽实验，外源添加从大豆根瘤中分离获得8 株根瘤菌菌悬液（表6），对其防治白菜根肿病的效果进行评估。8 株根瘤菌对白菜根肿病都有较好的防治效果，防治效果都在45%以上，其中防治效果最好的是RG-4菌株，相对防效为66.39%，防效与化学杀菌剂-氰霜唑（科佳）相比仅相差5.88%。结果表明根瘤菌在大豆白菜轮作模式中可能起到重要作用。

表6 根瘤菌对白菜根肿病的温室防效测定Tab.6 Determination of Rhizobium for bio-control Effect on Chinese cabbage disease

3 讨论

3.1 大豆白菜轮作模式减轻白菜根肿病的发生

十字花科作物根肿病在我国发生面积广，危害作物种类多。由于该病原菌不能离体培养，侵染机理不十分清楚，发生规律和影响因素极其复杂，侵染后难以彻底根除等特点。近年来国内外有学者研究证实，水旱间隔年限轮作对十字花科根肿病的控制具有良好效果[21]，十字花科作物与大蒜、黑麦草、红三叶草等非十字花科植物轮作能有效减少根肿菌在土壤中的数量[22-23]。

3.2 大豆白菜轮作模式对根际微生物的影响

作物根际土壤微生物作为指示根际土壤健康的重要指标，土壤微生物群落多样性对于作物健康至关重要，尤其是根际土壤细菌菌群结构的多样性结构组成和多样性程度与作物抗病能力呈正相关[24]。赵柏霞[25]等利用16S rDNA 基因文库分析相结合方法对蔬菜枯萎病的健康植株和患病植株比较分析，健康植株的优势菌群为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门以及放线菌门，厚壁菌门。大豆和油菜根际土壤共有的优势菌群为变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、放线菌门、子囊菌门、接合菌门、担子菌门和壶菌门，大豆根际土壤存在很多具有生防或促生作用的微生物细菌如鞘氨醇单胞菌，芽孢杆菌和根瘤菌等有益微生物[26]。本研究通过对白菜连作，大豆白菜轮作和大豆白菜轮作后秸秆还田的后茬白菜根际土壤微生物的微生物多样性进行分析，分析结果表明大豆白菜轮作模式的根际土壤细菌和真菌相对白菜连作模式下优势菌群发生了转变。白菜连作模式下目水平优势细菌菌群和真菌菌群为假单胞菌目（Pseudomonnadales）和肉座菌目（Ascomycota），大豆白菜轮作后优势细菌菌群转变为了Rhizobi‑ales、鞘脂单胞菌目（Sphingomonadales）、β-变形菌目（Betaproteobacteriales）、芽单胞菌目（Gemmatimonad‑ales），真菌菌群子囊菌门丰度显著下降，莫氏菌门丰度显著上升。这意味着大豆白菜轮作的模式增加了有益微生物的丰度，趋向于健康植株的根际微生物群落结构。进一步笔者比较不同栽培模式下白菜根际土壤微生物群落结构在属水平的差异，大豆白菜轮作相比白菜连作，真菌属的群落结构中小被孢霉属的相对丰度显著增加，细菌菌属鞘氨醇单胞菌属、土原生A4B 菌属、阿克曼菌属和芽单胞菌属的相对丰度显著增加，与前人的报道一致，植株越健康根际土壤中存在越多对可以用来防治植物病害或具有促生作用的微生物[27-28]，如具有生物防治潜能的鞘氨醇单胞菌属和芽单胞菌属[29]。本研究仅从不同栽培模式对土壤根际微生物的群落结构变化进行了研究，而植物内生菌的组成及变化情况有待于进一步探究。

3.3 根瘤菌在大豆白菜轮作模式控制根肿病起重要作用

根瘤菌与豆科植物在共生状态下具有生物固氮作用，也有研究发现根瘤菌作为生防菌对白菜根肿病具有防治作用。一些种类的根瘤菌对豌豆等豆类作物的根腐病等植物病害具有生物防治作用[30]。赵宇枢等[31-32]研究发现根瘤菌对胞囊线虫和抗胞囊线虫机理进行了研究。郝天雪[33]研究还表明根瘤菌是通过形成侵入线，侵染宿主细胞，然后形成外部为皮层和内部为中心组织的根瘤。

4 结论

本研究通过在白菜病土中轮作一季大豆和轮作大豆后秸秆还田可以减轻白菜根肿病害，防效达43.67%以上；并对大豆轮作及其秸秆还田后土壤中的根肿菌休眠孢子进行荧光定量检测，大豆轮作后土壤休眠孢子含量相对连作白菜土壤减少了约77%。大豆/白菜轮作模式控制白菜根肿病具有良好的效果，在农业生产中具有较好的推广前景。本试验通过温室盆栽证明根瘤菌对根肿病具有良好的防治效果，为进一步研究根瘤菌的田间防病效果及其生防机制提供了重要的生防细菌资源。