大蒜素抑制胃癌细胞上皮-间质转化作用及其机制*

徐丹，李瑞阳，李晶，王儒涵，兰婷，巩平

(石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科，石河子 832000)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是最常见的恶性肿瘤之一[1]，由于胃癌高侵袭性及高转移性，大多数患者确诊时已属晚期。研究发现[2]，上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)能使细胞获得侵袭、转移特征。大蒜素(allicin)是从大蒜中提取的挥发性油状物，其主要化学成分二烯丙基三硫化物(diallyl trisul fidc，DATS)是大蒜素发挥抗癌活性的主要物质[3]。有报道显示，大蒜素对宫颈癌、结肠癌等多种肿瘤均有明显抑制作用[4]，是理想的抗肿瘤药物。本研究以白细胞介素6(IL-6)体外诱导胃癌细胞系，构建胃癌细胞EMT模型，观察大蒜素对其E-钙粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)及核因子κB P65 (NF-κB P65)表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人胃癌细胞株HGC-27(中国科学院细胞库，目录号：TCHu 22) ；大蒜素注射液(Solarbio，规格：每瓶20 mg，批号：SA8720)；重组人IL-6(美国Peprotech公司，批号：031316-1) ；青链霉素混合液( Solarbio，批号：20170720)，RPMI1640培养基[塞默飞世尔(苏州)生物化学制品有限公司，批号：8117196]；二甲基亚砜(Solarbio，批号：520C0318) ；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司，批号：10091-148) ；Transwell试剂盒(美国康宁公司，批号：23317042)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所，批号：KS607)；Matrigel matrix(美国康宁公司，批号：7156009)；无菌超净工作台(上海力新公司)；二氧化碳(CO2)培养箱(美国ThermoScientific公司)；显微镜(日本奥林巴斯公司)；离心机(德国Eppendorf公司)；7500 FastReal-TimePCR system(美国AB公司)。

1.2方法

1.2.1细胞的培养 人胃癌细胞株HGC-27培养于含10%FBS、青链霉素混合液(×100)RPMI-1640培养基，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养箱培养。细胞70%～80% 融合时以胰蛋白酶消化传代，每2或3 d传代1次。共分为4组：空白对照组，培养胃癌细胞HGC-27，不作任何处理；IL-6组，常规培养胃癌细胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培养72 h；大蒜素组，常规培养胃癌细胞HGC-27，加入3 μg·L-1大蒜素培养48 h；大蒜素联合IL-6组，常规培养胃癌细胞HGC-27，加入50 ng·mL-1IL-6培养72 h，再加入3 μg·L-1大蒜素继续培养48 h。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链式反应(realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)实验 分组同“1.2.1”项，按照RNA提取试剂盒及反转录试剂盒说明，提取各组细胞 RNA并反转录为cDNA。按反应条件进行相关反应，每组设3个复孔。以肌动蛋白β(actin beta，β-Actin)为内参，将空白对照组mRNA表达量定为100%，以 2-△△Ct法计算E-cadherin、vimentin及NF-κB P65mRNA相对表达量，PCR反应条件为95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。各基因引物由上海生工生物公司设计合成，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.3CCK-8实验 取对数生长期胃癌细胞株HGC-27，胰酶消化，制成单细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔板(每孔2.0×103个)，细胞贴壁后弃去原培养液，分别以配制好的IL-6、大蒜素、大蒜素联合IL-6培养液处理，空白对照组加入等体积RPMI 1640混合培养液，置于37 ℃恒温细胞培养箱继续培养，分别于24，48和72 h加入CCK-8 试剂(每100 μL培养液含CCK-8试剂10 μL)，继续培养2 h，酶联免疫检测仪检测波长450 nm处各孔吸光度(A值)。

1.2.5Transwell体外侵袭实验 将1：8稀释Matrigel(RMPI 1640稀释)加入Matrigel侵袭小室上室，37 ℃放置2 h，水化基底膜，制备细胞悬液：按照“1.2.1”项分组，随后用胰蛋白酶消化各组处理好的细胞，终止消化后离心弃去培养液，无血清RPMI 1640培养基冲悬，借助细胞计数板调整细胞密度，接种6×104含无血清培养液于小室上室，向小室下室24孔板加入含20%FBS的RMPI 1640培养液，37 ℃培养48 h。取出侵袭小室，吸净上室培养基，甲醛固定20 min，结晶紫染色，磷酸盐缓冲液清洗3次，棉签轻轻擦净上室，倒置显微镜下计数膜背面细胞数，随机计数6个视野，取平均值，每组重复3次。

2 结果

2.1E-cadherin、vimentin及NF-κB P65表达情况 RT-qPCR检测结果显示，与空白对照组比较，IL-6组E-cadherin表达下调，vimentin及NF-κB P65表达上调(均P<0.05)；与空白对照组比较，大蒜素组E-cadherin表达上调，Vimentin及NF-κB P65表达下调(均P<0.05)；与IL-6组比较，大蒜素联合IL-6组E-cadherin表达上调，Vimentin及NF-κB表达下调，均差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.2CCK-8实验结果 见表2。与空白对照组比较，大蒜素组不同时间细胞增殖能力明显减弱，差异有统计学意义(均P<0.05)；与空白对照组比较，IL-6组不同时间细胞增殖能力更高(均P<0.05)；与IL-6组比较，大蒜素联合IL-6组不同时间细胞增殖能力减弱(均P<0.05)。见图2。

2.3细胞划痕实验 空白对照组、IL-6组、大蒜素组、大蒜素联合IL-6组12 h划痕愈合比分别为(27.78±6.72)%，(23.50±3.49)%，(5.70±3.85)%，(13.29±5.03)%；24 h划痕愈合比分别是(46.60±2.10)%，(51.06±2.11)%，(29.30±3.07)%，(36.43±0.96)%。与空白对照组12，24 h比较，大蒜素组划痕愈合百分比减小，差异有统计学意义(P<0.05)；与IL-6组12，24 h比较，大蒜素联合IL-6组划痕愈合百分比缩小(P<0.05)，尤其是24 h，IL-6组划痕处几乎被迁移细胞遮盖，而大蒜素联合IL-6组细胞迁移能力明显减弱(图3)。

①与空白对照组比较，t=-6.933～7.473，P<0.05；②与IL-6组比较，t=-4.052～3.575，P<0.05。

表2 4组细胞不同时间增殖能力比较(A450)

2.4Transwell体外侵袭实验结果 空白对照组、IL-6组、大蒜素组、大蒜素联合IL-6组每视野穿过Transwell侵袭小室的细胞数均呈正态分布，分别为139.00±9.35，161.40±18.93，91.00±12.21，109.60±2.51。与空白对照组比较，大蒜素组侵袭数目明显减少，IL-6组侵袭数目增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与IL-6组比较，大蒜素联合IL-6组侵袭数目表现出减少趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

EMT是许多肿瘤侵袭和转移的重要过程。在胃癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤发生发展的过程中均发现EMT作用[5]。在EMT发生中，常发现E-cadherin表达下调或E-cadherin-环连蛋白复合物功能失调[6]。存在于间充质细胞中的中间丝蛋白vimentin在调节细胞骨架蛋白、细胞粘附分子等方面也起到非常重要的作用。多条通路都能诱导EMT，很多研究认为，多种转录因子及其他调控因子、microRNAs、各种细胞微环境等可通过Wnt/β-catenin、EGFR/Ras和TGF-β/Smad等信号转导通路激活EMT[7]。然而，针对NF-κB信号通路的研究指出，在各类血液肿瘤或实体肿瘤中，例如黑色素瘤[8]、乳腺癌[9]和结肠癌[10]等，NF-κB的活性组成性高。而且NF-κB活性组成的抑制是通过抑制肿瘤细胞的组织侵袭和转移能力，降低转化细胞的恶性增殖能力等方式阻断肿瘤细胞的致癌性[11]。NF-κB是一种重要的转录调节因子，在刺激因素作用下，胞质中的抑制蛋白IκB发生磷酸化降解，解除了对NF-κB的抑制，释放其进入核内参与调节多种基因的转录表达，使其在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用[12]。

图2 4组细胞不同时间增殖能力比较

①与空白对照组比较，t=4.941～8.054，P<0.05；②与IL-6组比较，t=2.890～10.938，P<0.05。

①与空白对照组比较，t=2.372～6.979，P<0.05；②与IL-6组比较，t=-6.066，P<0.05。

大蒜素是多种烯丙基有机硫化物的复合体，天然存在于百合科植物大蒜的鳞茎中，其有效摄入可抑制多种肿瘤，如肺癌、肝癌及胰腺癌等的发生[13-14]。本研究探讨NF-κB信号通路是否在大蒜素对胃癌EMT作用机制中产生影响。RT-qPCR结果显示，与空白对照组比较，IL-6组E-cadherin表达下调，vimentin表达上调，说明IL-6诱导胃癌细胞发生了EMT；此外，与IL-6组比较，大蒜素联合IL-6组E-cadherin表达上调，vimentin表达下调，表明大蒜素对IL-6诱导胃癌细胞的EMT具有抑制作用，即大蒜素对经IL-6诱导胃癌细胞发生了EMT；同时大蒜素联合IL-6组NF-κB表达明显下降，故推测大蒜素可能通过调节NF-κB信号通路发挥对胃癌HGC-27细胞侵袭转移的抑制作用。通过增殖、迁移、侵袭等相关功能实验进一步证实，发生EMT的胃癌细胞系侵袭和转移能力均提高，而大蒜素可逆转这一过程。

此外，EMT也参与细胞外基质、基底膜降解和破坏的溶解酶，从而破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，便于细胞从原发肿瘤分离脱落，发生侵袭转移。因此，研究EMT分子调控机制可为研究预防肿瘤转移提供有利平台。有研究证实[14]，经大蒜素处理的胰腺癌细胞间质细胞表型向上皮细胞表型转化、侵袭、迁移能力明显减弱，与本研究的结果一致。CHEN等[15]研究发现，与对照组比较，大蒜素不仅可以显著抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，还可以下调肿瘤组织vimentin的水平。

综上所述，大蒜素能够抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，这种机制可能通过调节NF-κB信号通路，抑制IL-6诱导的胃癌细胞EMT效应实现，从而可能在有IL-6过表达的晚期肿瘤组织侵袭转移过程中发挥重要作用。但大蒜素对胃癌细胞具体的作用机制及NF-κB信号通路对EMT的调控作用有待进一步研究。