Capture-SELEX技术筛选β-苯乙胺核酸适配体

糜唯钰，段 诺，吴世嘉，姬 华，王周平

（石河子大学食品学院 新疆石河子832003）

β-苯乙胺是一种重要的芳香族生物胺，作为中枢神经系统中神经递质的调节剂，存在于哺乳动物组织中，高浓度的β-苯乙胺会导致β-内啡肽释放，诱导产生去甲肾上腺素，从而引发高血压和偏头痛等症状[1]。在奶酪、巧克力和腌制肉等食品中都存在β-苯乙胺。其潜在的毒性和作为食品质量标记的可能性，有必要对食品中的β-苯乙胺进行检测。对β-苯乙胺检测技术的研究在国内外已经开展多年，目前已建立多种检测方法，其中最主要的是基于分离技术的仪器分析法，例如高效液相色谱（HPLC）[2-5]，气相色谱（GC）[6-9]和毛细管电泳（CE）[10-12]等。这些方法可对β-苯乙胺进行精确的定量分析，然而也受到一些因素的限制，如仪器价格昂贵，检测耗时较长以及需要专门技术人员操作等。

核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集的配基系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），筛选获得的一种单链寡核苷酸（ssDNA 或RNA），可折叠形成三级结构，该结构可特异性识别并结合靶标。核酸适配体不仅具有与抗体相似的亲和力和特异性，而且还具有其它优点，例如更短的合成时间，更低的制造成本，更少的批次间差异性，更高的可修饰性，更好的热稳定性以及更广泛的目标种类[13-15]。基于此，核酸适配体被广泛用于临床诊断和治疗剂[16-18]，食品安全检测[19-21]和环境监测[22-24]等众多领域。

小分子靶标适配体的筛选大都采用在固相材料表面固定靶标分子的SELEX 技术，该技术存在固定操作复杂，固相材料的空间位阻和靶标分子构象可能改变等缺点。基于固定ssDNA 文库的捕获SELEX（Capture-SELEX）无需固定靶标分子，避免了上述问题，更适用于可溶性小分子靶标核酸适配体的筛选[25-27]。Capture-SELEX 技术通过特别设计的一段生物素化的反义寡核苷酸链，与核酸适配体筛选文库固定区域的一端互补结合，从而将ssDNA 文库固定在抗生物素蛋白包被的磁珠表面。筛选过程中，能够与靶标形成复合物的适配体从磁珠表面解离，通过收集上清，PCR 扩增，制备单链等步骤[28-30]，获得下一轮筛选的次级文库。经多轮筛选，就可获得对靶标具有高亲和力和特异性的适配体。

迄今为止，特异性结合β-苯乙胺的ssDNA 适配体尚无报道。本研究通过Capture-SELEX 技术筛选对β-苯乙胺具有高亲和力和特异性的ssDNA 适配体，并采用基于氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）的荧光法验证其亲和力与特异性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

ssDNA 文库，美国Integrated DNA Technologies（IDT）公司；正向引物P1、磷酸化反向引物P2、生物素标记的互补链P3、dNTP mix 和Taq plus DNA 聚合酶（200 U/mL）等，生工生物工程（上海）股份有限公司；β-苯乙胺和酪胺，美国Sigma-Aldrich 公司；酪氨酸、苯丙氨酸、组胺、色胺、多巴胺，阿拉丁试剂（上海）有限公司；GO，南京先丰纳米材料科技有限公司；Lambda 核酸外切酶（5 000 U/mL），New England BioLabs 生物公司；PCR 产物纯化试剂盒，上海捷瑞生物有限公司；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司；尿素【CO（NH2）2】、醋酸钠（CH3COON a）、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgC12）和氯化钠（NaCl）等，均为分析纯级，国药集团化学试剂有限公司。参照Duan 等[31]的方法制备亲和素包被磁珠。

1.2 仪器与设备

电子天平分析天平（AR224C），奥豪斯仪器中国有限公司；台式高速冷冻离心机（Centrifuge 54248），德国Eppendorf 公司；分光光度计【UVVis（NIR）UVProbe 2.33 版】，日本岛津公司；紫外-可见分光光度计（NanoDrop-2000 微量），美国Thermo Scientific 公司；扩增仪（C 1000 Thermocycler），美国Bio-Rad 公司；垂直电泳系统（Powerpac Basic Power Supply）、凝胶成像系统（Gel DocTM EZ Image），美国Bio-Rad 公司；荧光实时定量PCR 仪（7900HT），美国ABI 公司；多功能酶标仪（Synergy H1），美国BioTek 公司。

1.3 方法

1.3.1 随机ssDNA 文库和引物的构建 核酸如表1所示，人工构建合成长度为80 nt 的随机ss-DNA 文库，中间为40 nt 的随机序列区，两端固定序列各20 nt，作为PCR 的引物结合区域，该ssDNA 文库容量在1014以上。

表1 本研究用DNA 序列Table 1 The DNA sequences used in this study

1.3.2 Capture-SELEX 的筛选流程 Capture-SELEX 筛选流程如图1所示。

1）文库固定 设计一条与随机ssDNA 文库引物区互补的互补链P3，将其进行生物素标记。第1 轮筛选将1 000 pmol ssDNA 文库与P3 以物质的量比1∶1.5 加入1 mL 结合缓冲液（Binding buffer，BB）（50 mmol/L Tris-HC1，5 mmol/L KC1，100 mmol/L NaCI，1 mmol/L MgC12，pH 7.4）中，95 ℃变性10 min，在缓慢降温至37 ℃过程中互补杂交3 h。互补后ssDNA 文库与亲和素包被磁珠以质量比1∶300 孵育结合，37 ℃，130 r/min 反应6 h，通过亲和素与生物素的特异性结合，将ssDNA 文库固定在磁珠上，用BB 缓冲液清洗3 次以上，去除非特异性结合的ssDNA。孵育结合前、后，采用紫外分光光度法测定上清液中DNA 的紫外吸收，验证ssDNA 文库的固定情况。

2）孵育 第1 轮筛选体系为1 mL，固定ss-DNA 文库的磁珠与靶标（β-苯乙胺，初始浓度为0.1 mmol/L）37 ℃孵育2 h，与靶标特异性结合的ssDNA 从磁珠上解离下来，在缓冲液中形成ssDNA-靶标复合物。从第2 轮开始，筛选孵育体系为300 μL，每轮的筛选条件如表2所示。随着筛选轮数的增加，为获得高亲和力的适配体，逐渐增加筛选压力，包括减少ssDNA 文库用量，靶标的浓度以及孵育时间。此外，为了提高适配体的特异性，从第5 轮开始进行反筛，加入靶标的结构类似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组胺、色胺和多巴胺作为反筛靶标与ssDNA 文库孵育，弃包含反筛靶标-ssDNA 复合物的上清液，清洗磁珠后再加入靶标孵育。反筛，可以去除与靶标结构类似物结合的ssDNA。

3）PCR 扩增 在外加磁场作用下，收集与靶标结合的ssDNA，作为模板进行PCR 扩增。

4）酶切 PCR 产物用纯化试剂盒纯化后，用Lambda 核酸外切酶酶切PCR 产物。酶切产物用酚氯仿抽提法进行纯化，乙醇沉淀法回收，获得下一轮筛选的次级文库。用NanoDrop 微量紫外-可见分光光度计测定其核酸浓度。

图1 Capture-SELEX 的筛选流程图Fig.1 The selection procedure of Capture-SELEX

表2 Capture-SELEX 的筛选条件Table 2 The selection conditions in each round of SELEX

1.3.3 熔解曲线监测适配体富集 采用熔解曲线监测适配体在筛选过程中的富集情况。实时定量PCR 使用SYBR Green 染料。20 μL 反应体系中含10 μL SYBR Green Master Mix，引物P1 和P2（10 μmol/L）各0.4 μL。以1 μL 富集的文库作为模板，超纯水8.2 μL。PCR 方案：95 ℃预变性5 min，40 个循环，95 ℃10 s，60 ℃30 s。熔解曲线从软件7 900 v 2.4 获得，以此说明适配体筛选过程中的富集程度。

1.3.4 克隆测序及序列分析 最终获得的ssDNA文库经PCR 扩增，送生工生物工程（上海）股份有限公司克隆、测序。将测序获得的40 条序列，用DNAMAN V6 软件分析其同源性，用Mfold（http：//mfold.rna.albany.edu/）预测其二级结构并计算自由能（△G）。根据序列同源性，结合二级结构相似性，挑选出重复性高或△G 较低的序列共8 条。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成5' 端标记荧光素亚酰胺（FAM）基团的序列，用于后续亲和力和特异性试验。

1.3.5 亲和力和特异性试验 基于氧化石墨烯（GO）可吸附荧光标记的核酸适配体序列（ssDNA），不能吸附核酸适配体与靶标结合的复合物的原理构建荧光法测试适配体亲和力[32]。取不同浓度（10～200 nmol/L）适配体溶液100 μL，95 ℃变性10 min，立即冰浴。加入β-苯乙胺（10 μmol/L）于37 ℃震荡孵育2 h。孵育后加入最佳质量比（GO 与适配体的质量比为50∶1）的GO 震荡孵育30 min，吸附未与靶标结合的ssDNA。在4 ℃条件下，13 000 r/min 离心15 min，用Synergy H1 多功能酶标仪测定上清液的荧光强度（激发波长485 nm，发射波长520 nm），以无菌水代替靶标作为阴性对照。通过GraphPad Prism 7.0 软件拟合相对荧光强度（△F）对不同浓度适配体的非线性饱和结合曲线，计算解离常数（Kd值）。

式中：F——试验组的荧光强度；F0——阴性对照组的荧光强度。

对亲和力较强的候选适配体进行特异性试验。分别将靶标及其结构类似物——酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组胺、色胺和多巴胺（10 μmol/L）与适配体孵育，再与GO 震荡孵育后测定其荧光强度。通过计算和比较相对荧光比例评估适配体的特异性，其中相对荧光比例=△F试验组/△F靶标，△F试验组为加入靶标和结构类似物试验组与阴性对照组荧光强度差值，△F靶标为靶标试验组与阴性对照组荧光强度差值。以上试验均做3 次平行重复。

2 结果与分析

2.1 ssDNA 文库的固定

ssDNA 文库与生物素标记互补链P3 杂交互补后，通过生物素和亲和素的特异性结合将ssDNA 文库固定到磁珠表面，用于后续筛选。因ss-DNA 在波长260 nm 处有特征吸收峰，故文库的固定通过紫外分光光度法测定。如图2所示，固定前测得文库在260 nm 处的吸光度为0.843，固定后上清液吸光度为0.170，表明文库全部被固定至磁珠表面。

2.2 溶解曲线监测适配体筛选的富集

Capture-SELEX 筛选中，采用溶解曲线监测适配体的富集程度。溶解曲线分析与SELEX 方法及靶标性质无关，可作为不同SELEX 筛选方法的通用监测工具，并可应用于不同靶标（小分子、蛋白质、细菌和癌细胞）适配体的筛选。PCR 产物的溶解温度取决于其内部结构和双链体的稳定性。文库在PCR 过程中会形成异源双链和同源双链，其比例取决于序列的多样性。随着筛选的进行，与靶标结合的ssDNA 不断富集，次级文库的序列多样性降低。PCR 过程中会形成更多较稳定的同源双链，其溶解温度更高。如图3所示，溶解温度在第18 轮达到最大值，表明适配体在筛选过程中已经富集。

图2 ss-DNA 文库固定磁珠前、后的紫外吸收图Fig.2 UV-visible of ss-DNA library before and after immobilized magnetic beads

图3 Capture-SELEX 筛选2～18 轮的熔解曲线Fig.3 Melting curve of aptamer pool from 2-18 Capture-SELEX rounds

2.3 β-苯乙胺适配体序列分析

将第18 轮ssDNA 文库克隆测序，共获得40条序列。根据DNAMAN V6 和MFold 的分析结果，挑选出重复性高或△G 较低的序列共8 条，作为候选适配体（表3），用作后续亲和力试验。

表3 β-苯乙胺候选适配体序列Table 3 The sequences of aptamer candidates binding to β-phenylethylamine

2.4 亲和力和特异性试验

GO 的2D 表面结构和优异的能量转移能力使其能够通过π-π 堆积或氢键相互作用强烈吸附生物分子，并通过荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）机制对附近荧光物质进行荧光猝灭[33]。如图4所示，5'端标记FAM 基团的适配体和靶标孵育后，与靶标结合的适配体形成三维构象，无法与GO 稳定吸附结合，荧光基团不会被淬灭。而未与靶标结合的适配体稳定吸附在GO 表面，这是由于FRET 机制FAM 基团的荧光被淬灭。经离心分离操作，上清液为靶标-ssDNA 复合物，测定其荧光强度。

图4 基于GO 荧光分析法验证适配体亲和力的原理Fig.4 The principle of verifying the affinity of aptamers based on GO fluorescence method

2.4.1 氧化石墨烯添加量及孵育时间优化 为了保证GO 能完全吸附适配体，需要优化试验中GO的添加量。如图5所示，随着GO 的增加，体系中的荧光强度降低。F 为添加GO 孵育后的荧光强度，F0为未添加GO 时体系的荧光强度。当GO 与适配体的质量比为50∶1 时，适配体基本被GO 吸附，荧光淬灭。将GO 与适配体的质量比为50∶1作为后续试验中GO 的最佳用量。通过动力学曲线优化GO 与适配体的孵育时间。如图6所示，孵育时间30 min 时，荧光强度几乎被完全淬灭，因此GO 与适配体的最佳孵育时间为30 min。

图5 GO 浓度优化Fig.5 Optimize GO concentration

图6 GO 孵育时间优化Fig.6 Optimize GO incubation time

2.4.2 β-苯乙胺适配体亲和性试验 采用GO 荧光法测定β-苯乙胺8 条候选适配体序列的亲和性，Kd值越小，该序列亲和力越强。由图7 可知，适配体PHE-1、PHE-2 和PHE-8 对β-苯乙胺亲和力较强，Kd值分别为（67.54±15.88），（71.64±11.47），（80.46±12.57）nmol/L。选取上述候选适配体继续做特异性试验。

图7 GO 荧光法验证β-苯乙胺候选适配体结合饱和曲线Fig.7 The saturation curves of candidate aptamer toward β-phenylethylamine by GO fluorescence method

2.4.3 β-苯乙胺适配体特异性试验 为了进一步验证筛选核酸适配体的特异性，进行了反筛。反筛靶标酪胺、酪氨酸、苯丙氨酸、组胺、色胺和多巴胺与β-苯乙胺结构相似，且可能同时存在于检测体系中干扰检测。选择亲和力好的PHE-1、PHE-2和PHE-8 适配体与上述物质结合，以验证其特异性。如图8所示，PHE-1 对酪胺具有一定的结合能力，PHE-2 和PHE-8 特异性较好，并且适配体PHE-2 的Kd值较低【（71.64±11.47）nmol/L】，因此筛选获得的PHE-2 序列可作为与β-苯乙胺高亲和力和特异性结合的适配体。

图8 GO 荧光法验证适配体PHE-1、PHE-2和PHE-8 的特异性Fig.8 The specificity of aptamer PHE-1，PHE -2 and PHE-8 verified by GO fluorescence method

3 结论

采用Capture-SELEX 筛选小分子靶标β-苯乙胺的适配体，将第18 轮的PCR 产物克隆测序，共获得40 条序列。分析序列的同源性和二级结构，挑选出8 条候选适配体序列。采用GO 荧光法进行适配体亲和力和特异性试验。最后获得一条特异性识别β-苯乙胺的适配体（PHE-2），Kd=（71.64±11.47）nmol/L，表明基于Capture-SELEX技术成功筛选到β-苯乙胺适配体PHE-2，为研究和开发β-苯乙胺的分析检测方法提供了新思路。