山西老陈醋源植物乳杆菌C181对小鼠酒精肝损伤的保护作用

许 女，孙建平，陈旭峰，王佳丽，贾瑞娟，张 浩，王如福

（山西农业大学食品科学与工程学院 山西太谷030801）

近年的肝病统计数据表明，酒精性肝病己成为仅次于病毒性肝炎病症的第二大肝脏疾病。长期且大量饮酒会使线粒体及微管受到损伤，从而导致脂肪酸及乙醇的氧化过程受到阻碍，最终脂肪酸和乙醇大量堆积在肝脏细胞中，使肝脏细胞损伤严重。乙醇氧化成乙醛，乙醛具有较高的毒性和反应活性，在酒精性肝损伤中起到关键作用。除此之外，酒精性肝病发生之后，肝脏细胞合成与释放大量炎症因子能破坏肠黏膜细胞的紧密连接，增加肠道通透性，造成肠道损伤，肠道菌群异常（比如革兰氏阴性菌增多），产生的内毒素等有毒物质诱导炎症反应，进一步加重肝脏及其他器官的损伤。

许多功能性食品有助于降低疾病风险，提高代谢性和变性疾病患者的健康质量。其中一种具有代表性的功能性食品是益生菌。乳酸菌是一种益生菌，可抑制革兰氏阴性菌在肠道生长，维持肠道菌群平衡，保护肠道细胞，阻断内毒素由肠道转向肝脏。国内外许多学者把对益生菌的研究作为预防及治疗酒精性肝病的新方向。双歧杆菌被发现能够抑制肠道微生物群中病原体的生长，增加宿主的免疫系统，并具有抗肥胖、抗结肠炎和保护肝脏的作用。Zhao 等[1]报道，鼠李糖乳杆菌通过增强HIF 介导的信号转导，改善肠道上皮细胞的完整性和通透性，酒精肝的预防和治疗可以通过上调miR122a 以及抑制肝细胞的凋亡等来实现。发酵乳杆菌则通过清除活性氧（ROS），调节一氧化氮合酶（iNOS）和热激蛋白的表达来改善乙醇诱导的肝损伤[2]。Tian 等[3]也同样证实鼠李糖乳杆菌CCFM1107 主要是清除体内自由基，降低氧化压力，恢复平衡肠道菌群，以达到预防治疗酒精肝损伤的目的。另外，Chiu 等[4]做体外细胞试验，结果发现干酪乳杆菌MYL01 可以调节肝脏细胞的促炎因子（如：肿瘤坏死因子-TNF 和抗炎因子IL-10）的表达，减轻酒精诱导的肝细胞受损。Segawa 等[5]通过研究短乳杆菌SBC8803 的保肝、护肝作用也证实了此结论。其它益生菌（包括嗜酸乳杆菌等）在暴露于氧化应激的小鼠体内显示出对肝脏的保护作用[6]。这些结果表明，益生菌通过调节促炎细胞因子和胃、肠通透性来减轻肝脏损伤和胃炎。到目前为止，有关益生乳酸菌对酒精肝损伤的确切预防机制仍不清楚。

本文研究一株分离于山西老陈醋醋醅中的植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤的保护作用，为其进一步开发应用奠定了研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

植物乳杆菌C181（Lactobacillus plantarum C181），山西农业大学食品科学与工程学院生物工程实验室；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；白介素IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α、干扰素IFN-γ 测定试剂盒，武汉贝茵莱生物科技有限公司；游离脂肪酸测定试剂盒、总RNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；TaKaRa RR036A 反转录试剂盒、TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II，宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要仪器、设备

CFX96 荧光定量PCR 仪，美国BioRad 公司；SpectraMax i3x 酶标仪，美国Molecular Devices 公司；高速冷冻离心机，美国Sigam 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酒精诱导肝损伤小鼠实验

1）受试菌液的制备 将试验菌株按3%接种量接于MRS 液体培养基，37 ℃静置培养24 h，8 000 r/min 离心10 min，弃上清液，加无菌生理盐水洗涤菌体细胞2 次，调OD 值使菌液浓度分别达1010，108CFU/mL 和106CFU/mL。

2）酒精诱导肝损伤小鼠实验 50 只健康的昆明小鼠被适应性喂养1 周，将其随机分为空白对照组、酒精肝损伤模型组、植物乳杆菌C181 低、中、高剂量组，每组10 只。植物乳杆菌低、中、高剂量组每天分别灌胃浓度为106，108CFU/mL 和1010CFU/mL 受试菌液1 mL，酒精肝模型组和对照组的小鼠用生理盐水代替菌液，4 h 后空白对照组小鼠灌胃1 mL 纯净水，其它各组小鼠灌胃1 mL 52°红星二锅头白酒。自由摄取食物和水，动物房的温度（22±2）℃，湿度（56±5）%，饲养4 周。各组小鼠在实验最后一天禁食12 h，称重，摘眼球取血，将血样3 500 r/min 离心10 min，分离制备血清。小鼠脱臼死后，取其肝脏，称重，于-80 ℃超低温冰箱保存，备用。

1.3.2 指标测定

1）血清ALT、AST 活性和肝脏氧化应激指标的测定 按试剂盒说明书测定小鼠血清ALT、AST 活性以及肝脏SOD、GSH-Px 和MDA 氧化应激指标。

2）肝脏甘油三酯含量的检测[7]量取500 μL 肝脏匀浆液，充分混合于4 mL 氯仿-甲醇（体积比2∶1）脂质抽提缓冲液中，置于4 ℃过夜，8 000 r/min 离心10 min。将下层含脂质的有机相转至EP 管中干燥，用甘油三酯检测试剂盒测定分离出的脂质。

3）肝脏游离脂肪酸含量的检测 按照试剂盒说明书测定小鼠游离脂肪酸的含量。

4）肝脏炎症因子的测定 按照酶联免疫试剂盒说明书测定白介素IL-6、肿瘤坏死因子TNF-α、干扰素IFN-γ 的含量。

5）肝脏Nrf-2，NF-κB 和肠道ZO-1、Occludin、Claudin 基因的表达 提取肝脏和肠道组织的总RNA，反转录得到cDNA。用CFX96 荧光定量PCR 仪测定基因表达。各引物序列见表1。

表1 实时定量PCR 引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

6）肠道菌群测定 对小鼠粪便大肠杆菌、乳杆菌和双歧杆菌分别采用EMB、LBS 和BBL 培养基测定。

2 结果与讨论

2.1 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏甘油三酯和游离脂肪酸的影响

为研究植物乳杆菌C181 对酒精引起的小鼠肝脏脂肪堆积的影响，检测小鼠肝脏中的甘油三酯含量，结果见图1。酒精模型组小鼠与空白对照组小鼠相比，肝脏中TG 的含量明显升高，而灌胃植物乳杆菌C181 后小鼠的TG 含量明显降低。游离脂肪酸是导致氧化应激的主要物质之一，活性氧自由基和活性氮自由基被游离脂肪酸诱导生成，造成小鼠机体内的抗氧化机制失衡，最后损伤肝脏组织。由图1 可知，灌胃小鼠酒精4 周，其肝脏中游离脂肪酸的含量明显上升。植物乳杆菌能显著降低游离脂肪酸的含量，与空白对照组相比，没有显著性差异。

图1 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏甘油三酯和游离脂肪酸的影响Fig.1 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver triglyceride and free fatty acid in chronic alcohol-induced mice

2.2 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠的血清中的ALT、AST 活性和肝脏氧化应激的影响

ALT 和AST 是肝细胞重要的酶，诊断肝细胞受损重要的指标。正常条件下，小鼠的血清中这两种酶的活性很低。当肝细胞受损时，细胞膜的通透性增加，这两种酶进入血液中，血清中的酶活性显著增强，反映出肝细胞受损程度，是重要的检测肝功能的指标[7]。由图2 可知，酒精肝损伤模型组小鼠的血清中AST 和ALT 活性显著高于对照组小鼠，植物乳杆菌C181 能够显著降低酒精引起的血浆AST 和ALT 活性的升高，并与剂量呈正相关。综上，植物乳杆菌C181 能改善过量酒精摄入引起的小鼠肝损伤。

图2 植物乳杆菌C181 对小鼠血清中AST、ALT活性的影响Fig.2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on serum ALT，AST in chronic alcohol-induced mice

肝脏中的脂肪病变能够产生活性氧，对肝脏造成氧化损伤，从而加重非酒精性脂肪肝的病变程度。线粒体是脂肪氧化的主要场所，脂肪在肝细胞中积累的主要原因是线粒体发生异常，而线粒体异常使活性氧增多，加剧脂质过氧化和细胞因子的释放，最终导致细胞死亡，这是一种恶性循环，因此及时有效清除非酒精性脂肪肝产生的大量活性氧，对延缓/治疗非酒精性脂肪肝具有十分重要的意义[9]。Forsyth 等[10]利用慢性酒精性肝损伤模型证明益生菌LGG 能有效降低酒精引起的氧化应激，维持肠屏障功能，改善内毒素血症和肝损伤，进而改善酒精性脂肪性肝病。由图3 可知，与正常组相比，酒精模型组SOD 和GSH 水平显著降低，MDA 含量显著升高。给予植物乳杆菌C181灌胃后，各项指标均显著改善，其中，中剂量组和高剂量组与对照组相比，无显著差异。本研究结果与先前的报道[11-12]相似，证明益生菌可改善酒精引起的肝脏严重氧化损伤，也说明植物乳杆菌C181具有很强的抗氧化能力。

图3 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏中SOD、GSH、MDA 的影响Fig.3 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver SOD、GSH and MDA in chronic alcohol-induced mice

2.3 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏炎症因子的影响

大量研究认为，在酒精性肝病发生、发展过程中细胞炎症因子具有非常重要的作用。内毒素对Kupffer 细胞（库弗氏细胞，定居于肝脏内的巨噬细胞，在酒精性肝病中扮演重要角色）的激活除了会产生大量的自由基外，还会产生肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin 6，IL-6）、γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）等细胞炎性因子，它们损害人体正常细胞和组织，进而通过多种途径引起肝损伤。具有多种生物学功能的细胞因子TNF-α，是重要的调节因子，与免疫反应和炎症反应相关。研究表明，TNF-α 可通过与细胞膜上的受体结合，增加胞内活性氧的产量，这些活性氧能够损伤线粒体成分，如蛋白质、磷脂和线粒体DNA，诱导细胞凋亡[13]。

由表2 可知，酒精模型组促炎因子TNF-α、IL-6 和IFN-γ 的水平显著升高，抗炎因子IL-10的水平显著降低。灌胃植物乳杆菌C181 后，促炎因子分泌量显著降低，试验结束时接近正常对照组水平，其中IFN-γ 的含量甚至低于对照组，而IL-10 的水平显著升高。多项研究表明，益生菌通过促进促炎和抗炎因子的平衡来调节机体免疫失衡。Segawa 等[5]试验结果显示，口服加热至死的短乳杆菌SBC8803，可以降低酒精诱导小鼠肝脏中TNF-α 的mRNA 表达量。Hong 等[14]也发现灌胃鼠李糖乳杆菌R0011 和嗜酸乳杆菌R0052 或者其发酵上清液，可以显著降低酒精肝损伤小鼠肝脏中TLR4，TNF-a 和 IL-1 等炎症因子的表达。

表2 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏炎症因子的影响Table 2 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver inflammation factors in chronic alcohol-induced mice

2.4 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤的小鼠中肝脏Nrf-2，NF-κB 基因表达的影响

红细胞核因子（Nrf-2）是最近被认为的治疗酒精肝损伤的靶因子。Nrf-2 作为核转录因子，通过与抗氧化反应元件的相互作用，在多种防御基因：解毒酶、抗氧化酶等防御基因中起重要作用[15]。Nrf-2 与细胞质中的特异性抑制因子相结合，导致Nrf-2 的活性受到抑制。在氧化刺激下，Nrf-2 与抑制因子分离，转运到细胞核并与转录因子结合。然后，Nfr-2 复合物与抗氧化反应元件（ARE）结合，促进抗氧化基因的转录。乙醇诱导的氧化压力及肠道屏障破坏引起的内毒素、脂多糖升高，从而导致炎症，它们是酒精肝损伤的重要病理指标。肠屏障损伤被认为是酒精性内毒素血症的主要原因之一。肠屏障损伤引起的肠内脂多糖（LPS）增加，可能通过促进肝脏炎症过程在ALD的发病中起重要作用，这种增强的炎症反应会进一步损害肠道屏障功能。脂多糖与Toll 样受体TLR4 结合诱导了NF-κB 基因的活性，促使细胞因子（cytokines）和趋化因子（chemokines）等炎症因子的产生，这些过度产生的分子最终导致肝脏慢性炎症的恶性循环[16]。

本研究结果表明：植物乳杆菌C181 显著提高了酒精诱导小鼠肝脏中Nrf-2 基因的表达水平，并且降低了NF-κB 的表达水平。Ahmed 等[17]研究了Nrf-2 和NF-κB 的相互作用，证明Nrf-2 的激活可以抑制NF-κB 的表达。

2.5 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肠道菌群的影响

2009年，Keshavarzian 等[18]通过慢性酒精性肝损伤大鼠模型实验，发现酒精引起肝损伤外肠道出现损伤，大鼠肠道的通透性增加，内毒素肠渗漏。在酒精性肝病中出现肠道损伤的原因可以用“肝肠轴”原理解释。酒精性肝病发生后，肝脏细胞合成并释放大量炎症因子，破坏肠黏膜细胞的紧密连接，造成肠道损伤。酒精性肝病造成肠道损伤后，患有酒精肝的小鼠肠道中内毒素透过小肠黏膜进入血液，并进入肝脏，加重肝脏的损伤。本文对大肠杆菌、双歧杆菌和乳杆菌进行定量分析，研究肠道菌群变化与酒精肝损伤之间的关系。各组粪便样品中细菌定量分析结果见图5。正常对照组和酒精模型组相比，大肠杆菌数量显著增高了1 个数量级，摄入植物乳杆菌C181 后大肠杆菌的数量显著下降，与对照组比差异不显著。与对照组相比，酒精模型组中的乳酸杆菌和双歧杆菌数量呈现显著下降，下降1 个数量级。摄入植物乳杆菌C181 后，乳酸杆菌和双歧杆菌的数量都显著提高，高剂量组接近对照组，其中乳酸杆菌的数量甚至高出对照组2 个数量级。

图4 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肝脏Nrf-2，NF-κB mRNA 表达的影响Fig4 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on liver Nrf-2，NF-κB mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

图5 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肠道菌群的影响Fig.5 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal floras in chronic alcohol-induced mice

2.6 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肠道相关基因表达的影响

Zhong 等[19]通过酒精性肝病小鼠模型证明慢性酒精会导致肠道紧密连接受损，肠道通透性升高，进而导致脂多糖吸收量增加，最终导致肝脏损伤。Kirpich 等[20]发现益生菌通过调整肠道菌群和肝脏酶活水平缓解患者的酒精性肝损伤。肠上皮细胞屏障主要由紧密连接控制，它是肠黏膜屏障具有选择通透性的基础，以维持机体内环境的稳定。由于紧密连结蛋白ZO-1、Occludin、Claudin 是构成紧密连结的重要组成成分[21]，因此对ZO-1、Occludin、Claudin 的表达情况进行研究。图6 结果显示，4 周慢性酒精摄入后，ZO-1、Occludin、Claudin 的mRNA 表达水平明显下降。加入植物乳杆菌C181 后，三者mRNA 的表达水平明显升高，并与剂量呈正相关，表明植物乳杆菌C181 能有效改善慢性酒精引起的肠道屏障完整性、通透性相关基因的表达水平。

图6 植物乳杆菌C181 对酒精肝损伤小鼠肠道ZO-1、Occludin 和Claudin 基因表达的影响Fig.6 Effect of Lactobacillus plantarum C181 on intestinal ZO-1，Occludin and Claudin mRNA levels in chronic alcohol-induced mice

3 结论

本研究表明：山西老陈醋源植物乳杆菌C181可以通过上调酒精诱导小鼠肝脏中红细胞核因子Nrf-2，下调NF-κB 基因的表达水平，从而调节肝脏的氧化应激和炎症因子的分泌，改善缓减酒精引起肝损伤。另外，C181 还显著提高了肠道紧密连接蛋白相关基因ZO-1、Claudin 和Occludin 的表达，增强了肠道黏膜屏障功能，维持肠道菌群平衡和内环境的稳定，达到预防酒精性肝病的目的。本文为益生菌的酒精肝损伤预防机制以及保肝护肝微生态制剂的开发提供了基础数据。