环介导等温扩增对人乳头瘤病毒可视化分型检测

张可欣，杨思熙,王丽娜，刘金霞，邢恩鸿

(1.承德医学院 病原生物学实验中心，河北 承德067000;2.承德医学院附属医院 妇科，河北 承德067000)

乳头瘤病毒(HPV)是一种乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒，目前已发现140余种亚型[1]。不同亚型的 HPV感染所导致的后果也不同，低危型主要可导致寻常疣和良性病变，而高危型主要可导致宫颈上皮内瘤病变或者是宫颈癌[2]，最新研究表示， HPV感染也与动脉粥样硬化和口咽癌的形成有关[3-4]。因此，早期识别HPV感染，对预防可能发生的疾病有着重要的指导作用。

目前，临床上对于 HPV的诊断手段主要以斑点杂交或原位杂交为主[5-6]，这种方法需要配套的昂贵设备才能完成，不适用于基层医院或社区现场进行 HPV的筛查和分型。环介导等温扩增(LAMP)技术是在2000年由日本学者 Notomi开发的一项适用于基因诊断的技术[7]，具有特异性强、结果可用肉眼判定、无需特殊装置的优点。本实验将基于该技术对HPV16、18、52、58亚型临床标本进行检测并分型，旨在探讨LAMP在临床的使用前景。

1 材料与方法

1.1 试剂

Bst DNA聚合酶和10X reaction buffer购自美国NEB公司，钙黄绿素购自Sigma公司，100 bp DNA Marker购自TaKaRa公司，PCR Mix购自TIANGEN公司。

1.2 标本采集

收集承德医学院附属医院2018年8月-2018年10月部分就诊患者宫颈脱落细胞悬液共155例，其中4例经该院检验科使用潮州凯普公司HPV分型试剂盒检测后HPV16、18、52、58感染，其余151例未知亚型。

1.3 DNA模板制备

DNA模板制备将标本混合均匀后，15 000 r/min离心5 min，弃上清，留沉淀，加入50 μl核酸裂解液，100℃煮沸5 min，-20℃保存备用。

1.4 LAMP特异性引物

根据GenBank公布的HPV16亚型(GenBank登录号： EU869318.1)、18亚型(GenBank登录号： KY457840.1)、52亚型(GenBank登录号： EU924144.1)和58亚型(GenBank登录号： KU298920.1) E6、 E7区域为参考序列，应用 Clustal Omega软件进行序列对比，选取其保守区域，用 LAMP专用引物设计软件(Primer Explorer V5)设计每种亚型的4条引物，引物序列见表1，其中 F3和 B3为外部引物，FIP和 BIP是内部引物，所有引物均委托上海生物技术有限公司进行合成。

表1 HPV病毒的LAMP引物序列表

1.5 临床标本的检测

分别应用LAMP和PCR两种检测方法对155例临床标本逐个检验。 LAMP体系根据前期体系优化结果，分别采用以下体系配置反应液(表2)，65℃水浴1 h后，置冰上停止反应，观察可视化结果，黄色提示阴性，绿色提示阳性。 PCR扩增实验以LAMP外引物(F3/B3)为上、下游引物。 采用25 μl体系：12.5 μl PCR Mix，1 μl F3/B3，1 μl DNA模板，其余用ddH2O补足。 扩增条件： 94℃ 3 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30 个循环;72℃ 5 min。 结果判断：取5 μl产物，采用2% 浓度的琼脂糖凝胶开展电泳实验观察结果，在凝胶成像仪下观察电泳条带。

表2 LAMP 反应体系

1.6 LAMP特异性检测

通过互换模板实验验证 LAMP的特异性，分别以 HPV16、18、52、58亚型 DNA及双蒸水为模板，应用4套特异性引物进行 LAMP扩增，根据琼脂糖电泳结果和染色结果判断引物特异性，每种亚型的特异性检测重复4次以上。

1.7 LAMP和PCR灵敏度检测

对经荧光定量 PCR检测后所含菌量约为2×106IU/μ L的 HPV DNA进行梯度稀释，对最终拷贝数分别为104、103、100、10 IU/μ L的模板，分别进行 LAMP和 PCR扩增，并通过 LAMP可视化结果及2%琼脂糖凝胶电泳进行灵敏度分析，对 LAMP的灵敏度检测重复4次以上。

1.8 统计学分析

应用SPSS21.0软件比较LAMP和PCR对155例标本检测结果的一致性。Kappa值为0.4-0.7时一致性一般，>0.7时一致性好。

2 结果

2.1 特异性实验

分别对HPV四种亚型进行模板互换扩增实验后，琼脂糖电泳结果如图1A、C所示，其中16、18、52、58所囊括的泳道分别代表使用该亚型引物进行扩增后的产物电泳图，泳道16、18、52、58分别对应 HPV四种亚型模板。由图可知，每种亚型的特异性引物仅可扩增该亚型模板，其余模板及阴性对照均未被扩增，表示本文中建立的 LAMP体系特异性较好，不受其他模板的扰乱。

钙黄绿素染色效果如图1 B、D所示，各管按排列顺序同上，经比较可得两种检测产物方法结果一致，可通过简单的肉眼观察代替电泳检测。4次重复实验结果均与以上结果相当。

图1 LAMP检测HPV的特异性

2.2 灵敏度实验

分别应用PCR和LAMP对一系列梯度稀释后的HPV DNA进行扩增，扩增结果如图2所示。图2A表示HPV16亚型的LAMP检测限为100IU/ μl，HPV18的LAMP检测限为103IU/μL；图2D表示HPV52亚型的LAMP检测限为100IU/μL，HPV58亚型的LAMP检测限为103IU/μL； 图2C、F表示HPV16、18、52、58亚型的PCR检测限均为103IU/μL。由此可知LAMP对HPV16、52亚型的检测限均比PCR高一个数量级。

图2B、E表示钙黄绿素的可视化结果，绿色表示阳性、黄色表示阴性，排列顺序同上，与电泳结果对比后可知其染色效果与电泳结果相当。4次重复实验结果如表3所示，均与以上结果相当。

图2 LAMP和PCR的灵敏度检测

表3 LAMP的重复性实验

2.3 临床标本检测

LAMP扩增105例经 PCR检测为阳性的标本和50例阴性标本后，将两种分型结果进行一致性比较，结果如表4所示。在105例经PCR确认为阳性的标本中，LAMP检测出99例，灵敏度为94.29%。在50例经PCR确认为阴性的标本中，LAMP检测出46例，特异性为92.0%。应用SPSS对其进行一致性检验和卡方检验后得出， LAMP与 PCR检测有极好的一致性(Kappa值=0.854)。

表4 LAMP和PCR的一致性比较

3 讨论

宫颈癌作为世界女性最多见的恶性肿瘤之一，一直受到较大重视。近年来，经研究证实，高危型 HPV的反复持续感染与其产生息息相关[8]，且不同亚型 HPV所导致的结果也不尽相同[9]。因此，早期识别HPV感染并对其进行分型检查是防治宫颈癌的必要基础[10]。目前国内医院针对HPV的检测及分型普遍为斑点杂交或原位杂交[11-13]，但需要大型仪器和昂贵的设备，不适合基层或现场检测。因此临床上正亟待一种更为方便、简单的诊断方法用来补充甚至替代原有的HPV诊断方法。

本文中所使用的 LAMP技术是在2000年由日本学者 Notomi公布的一项可在恒温状态下进行扩增的基因诊断技术，是一种快速、便携、低成本的检测方法，现已广泛用于疾病检测方面[14-16]，本研究在原有的 LAMP技术基础上进行了一些改良，主要改良方面总结如下： 1)模板提取的改良。由于Bst酶的抗干扰能力比较好，因此可以将收集的临床标本直接煮沸进行核酸的粗提，省去繁杂的核酸纯化过程，使核酸提取步骤大大简化。2)结果判定的改良。LAMP的结果判定常用浊度法，该方法单用肉眼难以判定结果，需要用浊度仪检测才能确定扩增结果，判断起来比较不便。本研究在扩增反应开始前向体系中加入钙黄绿素，利用其颜色改变进行结果判定，使其即不抑制扩增，又可使结果可视化，使结果判定更加简单。

本文中建立的 LAMP体系为 HPV的分型检测提供了初步探索经验，如果能在此基础上对该技术进行进一步改良，如制作基于 LAMP技术的便携式核酸扩增检测仪或开发一步法封闭式检测管，必将更有利于应用 LAMP技术在基层或现场进行检测。