甜荞资源萌发期耐旱性鉴定体系建立与种质筛选

侯泽豪，卢奕霏，孙坤坤，王书平，张迎新，刘志雄，方正武

(1.长江大学农学院/主要粮食作物产业化湖北省协同创新中心，湖北 荆州 434025；2.长江大学园艺园林学院，湖北 荆州 434025)

荞麦属廖科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrumspp.)，是一年生或多年生的重要经济作物，有甜荞(FagopyrumesculentumMoench)和苦荞(FagopyrumtataricumGaertn)2个栽培种[1]，是重要的药食兼用作物。荞麦广泛种植于中国、俄罗斯、欧洲和北美的高海拔地区[2]。在中国，荞麦主要分布于北部和中西部地区，特别是云贵高原﹑川西以及西北地区的高海拔地带[3]。由于这些地区水资源短缺，土壤干旱极易导致荞麦种植区季节性缺水，尤其播种时的干旱严重影响了荞麦生长发育和产量形成[4]，培育具有耐/抗旱的品种是应对干旱气候最为有效和经济的途径之一[5]，鉴定与筛选具有耐/抗旱性的种质资源则是其前提与基础[6]。荞麦的耐旱性鉴定缺乏规范的鉴定体系[7]，且对于不同来源或不同生境下的荞麦种质资源的抗旱性评价报道较少。

聚乙二醇(PEG)作为一种高分子渗透剂，用于模拟干旱胁迫可达到与土壤控水相同的效果[8]，具有操作简单、试验周期短和重复性好等特点[9]，因此，PEG模拟干旱胁迫已成为农作物、林木、蔬菜和花卉等植物早期抗/耐旱性的重要方法之一[10-11]。植物种子萌发期是感应外界环境改变的最初阶段，这一阶段的耐旱情况可直接或者间接反映植物耐旱性的强弱[12]，但由于植物的耐旱性是诸多因子相互作用和影响的结果，受形态、解剖和生理生化特性等控制[13]，且在不同植物和同一植物的不同品种之间，由于遗传背景、发育阶段的代谢特征及生长发育环境等造成的差异，使得植物体内的生理生化特征也处于一个多变状态[14]。因此，采用多指标，并结合聚类分析、主成分分析、灰度关联和隶属函数等进行综合评价，能有效提高鉴定的准确性[15]，在小黑麦[16-17]、玉米[18]、花椰菜[19]和苜蓿[20]等种质资源萌发期耐旱种质筛选中得到广泛应用。

本研究采用PEG6000高渗溶液模拟干旱胁迫的方式，对80份不同来源的甜荞种质资源进行耐旱性鉴定，旨在建立荞麦萌发期耐旱性鉴定和分级体系，筛选耐旱性强的荞麦种质资源，为荞麦耐旱新品种的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为课题组征集并保存的来自全国各地的80份甜荞种质材料，材料编号及来源见表1，其中地方种质资源34份，育成品种46份。

表1 参试甜荞种质资源名称及来源Table 1 Information of the tested common buckwheat germplasm resources

1.2 甜荞萌发期耐旱鉴定体系建立

为明确模拟干旱胁迫的最适PEG6000体积分数，选取7个已报道[7,21]的不同耐旱性的种质资源进行萌发期耐旱鉴定体系建立初步摸索，材料信息见表2。

表2 萌发期耐旱鉴定体系建立供试材料及耐旱性等级Table 2 Information of 7 common buckwheat for establishment of buckwheat drought tolerance identification system

萌发期耐旱鉴定体系设置10%、20%、25%和30%PEG6000溶液共4个体积分数水平，以蒸馏水为对照，共5个处理。每个处理设置3次生物学重复，每个处理50粒种子。参考《国际种子检验规程》[22]进行荞麦种子的干旱胁迫萌发试验。选取颗粒饱满，大小一致的荞麦种子，经0.1% HgCl2溶液消毒10 min后，使用无菌水冲洗数次直至将HgCl2残余冲洗干净后，置于铺有两层滤纸发芽床的种子发芽盒(13 cm×19 cm×12 cm)中，以滤纸充分湿润为标准加入相应体积分数水平的PEG6000溶液。于人工气候箱(JYC-412，上海佳语科学仪器有限公司)中进行恒温恒湿培养：参数设置为温度25℃，湿度60%，12 h光照/12 h黑暗。每天添加适量体积的无菌水以维持PEG6000溶液的体积分数恒定。

1.3 甜荞种质资源的耐旱性鉴定

通过耐旱性体系建立，明确了用于耐旱性鉴定的PEG6000溶液最适浓度，设置干旱胁迫组(DT)和对照组(CK)两组处理，每组处理设置3个生物学重复，对80份甜荞种质资源材料进行耐旱性鉴定，鉴定培养条件同1.2。

1.4 耐旱指标测定与计算

每天统计种子发芽数(以胚根突破种皮2 mm为发芽标准)，直至第7天。于第7天计算发芽率，并随机挑取10株幼苗，利用直尺对其株高及根长进行测定。

发芽率(%)=第7天正常发芽种子数/供试种子数×100%

相对发芽率(RGR)=(干旱胁迫下种子发芽率/对照种子发芽率)×100%

萌发抗旱指数(SIDR)[23]=(1.00 ×nd1+0.75×nd3+0.50×nd5+0.25×nd7)×100%(式中nd1、nd3、nd5和nd7依次为第1、3、5、和7天的种子相对发芽率)

相对株高指数(RPHI)=(胁迫下幼苗株高/对照幼苗株高)×100%

相对根长指数(RRLI)=(胁迫下幼苗根长/对照幼苗根长)× 100%

株高胁迫指数(PHSI)=[(对照幼苗株高-胁迫下幼苗株高)/对照幼苗株高]×100%

根长胁迫指数(RLSI)=[(对照幼苗根长-胁迫下幼苗根长)/对照幼苗根长]×100%

1.5 数据统计分析

利用Excel 2019和SPSS 19.0进行数据整理和统计分析，利用SPSS 19.0对数据进行单因素方差分析，并采用Duncan法进行多重比较。运用R语言的stats包对数据进行聚类分析与相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同干旱胁迫水平下甜荞种子的萌发

由表3得知，不同程度水分胁迫对各参试材料相对发芽率(RGR)和萌发抗旱指数(SIDR)的影响程度不同，随着胁迫程度的加剧呈现下降趋势。10% PEG6000溶液胁迫对各参试材料的相对发芽率影响较小，但萌发抗旱指数存在显著差异，其中定甜荞1号(YZU-39)显著高于其他品种。在20% PEG6000溶液胁迫下，RGR和SIDR变幅分别为72.22%～101.12%和50.82%～101.62%；宁麦1号(YZU-38)的RGR显著低于其他，但SIDR与蒙0207(YZU-44)和榆荞1号(YZU-45)无显著差异。YZU-39和北早生(YZU-62)在25% PEG6000溶液胁迫下，其RGR和SIDR均显著高于其他品种，而YZU-38和YZU-44在25% PEG6000溶液胁迫下，其相对发芽率和萌发抗旱指数显著低于其他品种。当水分胁迫水平达到30%时，YZU-39和YZU-62的相对发芽率在10%以下。

表3 不同干旱胁迫水平对荞麦种子萌发的影响Table 3 Effects of different drought stress levels on seed germination of buckwheat

2.2 不同干旱胁迫水平下甜荞的生长

由表4可知，随着水分胁迫程度的加剧，甜荞幼苗的生长发育所受影响也在加剧，表现为相对株高指数(RPHI)下降和株高胁迫指数(PHSI)上升。在浓度为10% PEG6000溶液浓度下，各品种的RPHI在22.99%～67.99%之间，在干旱敏感品种(YZU-44和YZU-45)中表现出了较为严重的伤害。干旱胁迫水平达到20%、25%PEG6000时，幼苗的生长受到了显著的抑制作用；在30%PEG6000的高强度水分胁迫下，除了耐旱性较强的品种YZU-39和YZU-62外，其他品种幼苗的生长均受到了极大抑制作用。

不同干旱胁迫水平对荞麦幼苗根长的影响如表5所示，整体表现为在较低的干旱胁迫下(10%PEG6000)，对根部生长的影响程度较小，甚至有促进根的生长作用，当干旱胁迫水平达到20%PEG6000以上时，表现为相对根长指数(RRHI)显著下降和根长胁迫指数(RLSI)升高，干旱胁迫对根生长影响随着胁迫水平的提高而增大；当胁迫达到25%PEG6000时，各品种的RLSI均在90%以上；30%PEG6000时绝大多品种的RLSI达到了100%，幼苗根的生长受到了极大地抑制。

表5 不同干旱胁迫水平对荞麦幼苗根长的影响Table 5 Effects of different drought stress levels on root length of buckwheat

2.3 甜荞种质资源萌发期耐旱性鉴定

如图1所示，20% PEG6000胁迫下，参试品种RGR、SIDR、RPHI、PHSI、RRHI和RLSI均呈现近似正态分布，且表现出明显的差异。RGR变幅为0～93.33%，变异系数为72.14%；SIDR变幅为0～87.47%，变异系数为79.06%。RPHI和PHSI的变幅分别为0～19.72%和80.28%～100%，而RRHI和RLSI的变幅分别为0～29.15%和50.85%～100%。研究结果表明参试甜荞种质资源在干旱胁迫下萌发与生长差异较大。

聚类分析得出(图2)，80份种质资源共聚成4类，其中YZU-33耐旱性最强，与YZU-08和YZU-44聚为第1类，为耐旱性极强种质，将这3份种质资源材料的耐旱等级定义为1级；YZU-39(定甜荞1号)、YZU-62(北早生)与其他11份种质资源聚为第2类，为耐旱型种质，将这13份种质资源材料的耐旱等级定义为2级； YZU-63(西农9976)、YZU-64(西农9978)等33份种质资源聚为第3类，为耐旱性较弱种质，将其耐旱性等级定义为3级；YZU-38(宁荞1号)、YZU-44(蒙0207)和YZU-45(榆荞1号)等31份种质资源聚为第4类，为干旱敏感型种质，耐旱性等级定义为4级。

相关性分析结果表明(表6)，耐旱等级与RGR、SIDR、RRHI呈显著负相关，相关性分别为-0.92，-0.94和-0.85(P<0.05)，与RLSI呈显著正相关，相关性系数为0.85，与RPHI和PHSI无显著相关性。该试验结果表明荞麦种质资源的耐旱性越强，在受到干旱胁迫时维持发芽和地下部生长的能力越强，但与地上部生长关系不紧密。因此，相对发芽率(RGR)、萌发抗旱指数(SIDR)、相对根长指数(RRHI)和根长胁迫指数(RLSI)可作为荞麦萌发期耐旱性鉴定的有效指标。

表6 耐旱等级与各生长指标的相关性分析Table 6 Correlation analysis of drought tolerance grade and growth indexes

3 讨 论

植物种子萌发期作为感应外界环境改变的最初阶段，耐旱性强弱与其是否能发育为健壮植物有着较高的关联性[24]，建立萌发期耐旱性鉴定体系对于培育耐旱品种具有重要意义[25-26]。PEG6000高渗溶液模拟干旱胁迫发现，10%PEG6000干旱胁迫对甜荞种子的萌发率和根的生长影响较小，甚至对于某些品种具有促进作用，随着PEG6000高渗溶液浓度的升高，种子萌发率、萌发抗旱指数、株高和根长等各项指标呈下降趋势，20%PEG6000溶液为荞麦萌发期耐旱性筛选与鉴定的适宜胁迫浓度。这与对芒果[27]、藜麦[28-29]、花椰菜[19]和扁豆[11]种子萌发影响的研究报道结果基本一致，但不同作物对PEG浓度响应各不相同[19]，因此，筛选适宜的耐旱性鉴定胁迫浓度可提高耐旱性鉴定的准确性。

植物的耐/抗旱性是多基因控制的数量性状，在植物的耐/抗旱性评价体系中，国内外学者普遍采用多指标相结合的耐/抗旱指标和评价方法[20,30]。应用灰度关联分析、模糊数学隶属函数法和聚类分析等方法可对植物的耐旱性进行综合评价，如单云鹏等[31]采用隶属函数法与聚类分析相结合的方法对235份小豆种质资源材料进行综合评价，筛选得到了15份抗旱种质；王焱等[20]则在59份苜蓿种质资源材料中筛选得到了3份极强抗旱型种质。本研究将80份甜荞种质资源分为4类，筛选到了3份耐旱性极强的农家种种质资源，可作为选育耐旱型荞麦品种的基础材料。

种子萌发期作为决定作物基本苗数和群体结构建成的关键阶段，该时期受到干旱胁迫极易对作物的生产造成严重影响[19]，因此确立作物萌发期耐旱性鉴定方法和指标，筛选简单快捷的耐旱评价指标以提高材料筛选效率[32-33]，并在萌发期进行种质资源耐旱性鉴定对耐旱性育种具有重要意义[34]。Bouslama等[23]根据种子在高渗溶液或不同渗透势土壤中的发芽势和发芽率来评价萌发期的耐旱性，并提出种子萌发抗旱指数。大量的研究发现种子发芽率、发芽势和发芽指数等可作为植物萌发期耐旱性评价的参考指标[35-36]。在水稻[37]、油菜[38]和大豆[39]等作物的萌发期抗旱性研究中发现萌发耐旱指数与种质资源的耐旱性显著正相关，在本次研究中，甜荞的耐旱性与萌发抗旱指数呈显著正相关，表明萌发抗旱指数是甜荞种质资源耐旱鉴定的有效指标。此外，在萌发期耐旱性鉴定过程中，除了关注发芽势和发芽率等种子萌发性状外，还可以采用相对苗高和相对胚根长等幼苗生长势相关指标以全面体现种质资源的出苗率及幼苗健壮程度[40-41]，如余贵海等[42]和成锴等[43]利用PEG胁迫条件下的发芽率、胚根长和胚芽长等性状对玉米萌发期耐旱性综合评价；张春宵等[33]的研究发现结合发芽率、胚芽干重和贮藏物质转运率可以比较全面地评价土培条件下玉米萌发期的耐旱性。张海平等[39]研究发现结合相对发芽率、萌发耐旱指数、相对株高和相对苗高等指标可以全面且直观地反映出大豆种子在萌发期的耐旱性。本次研究中，荞麦萌发期的耐旱性与相对根长指数显著相关，但与相对株高指数相关性较低，这与前人的研究结果基本一致[7,44]。本次研究结果表明RGR(相对发芽率)、SIDR(萌发抗旱指数)、RRHI(相对根长指数)和RLSI(根长胁迫指数)可以作为荞麦萌发期耐旱性鉴定的有效指标。