大豆DNA脱甲基化酶相关基因的克隆及连作胁迫应答

方淑梅，侯 雪，邱草威，韩 蓓，胡俊杰，梁喜龙

(黑龙江八一农垦大学，黑龙江 大庆 163319)

大豆作为粮油饲兼用型农产品和重要的工业原料，一直是世界各国不容忽视的重要作物之一。而近些年来我国大豆生产在进口大豆的冲击下，种植面积日益缩减，结果形成目前大豆可种植范围小，种植地域集中，实现有效轮作非常困难的局面，因此连作现象难以避免[1-2]。大豆连作后会产生生物危害、植物化感自毒作用、土壤理化性状劣变及营养失衡等多种障碍，即连作障碍[3-6]。连作障碍是大豆正常生长发育的重要限制因子，严重制约了大豆产量，导致的减产幅度可高达35%[7]。因此与大豆连作障碍有关的基础科学问题成为众多学者关注的焦点。

研究显示，逆境胁迫能够诱导植物的DNA甲基化状态发生改变，而甲基化状态变化可影响染色质结构，改变遗传信息量并赋予特定的遗传属性，进而调节基因表达活性，为植物适应不良环境提供可塑性[8-10]。大量研究表明，多种逆境胁迫如温度、高盐、渗透、水分、重金属及营养元素缺乏等均可通过诱导DNA甲基化的动态变化调控逆境应答基因的表达, 从而提高植物的环境适应能力[11-12]。例如：高渗胁迫诱导拟南芥基因组DNA特定区域转座子超甲基化形成“短期胁迫记忆”，并通过雌性种系传递给后代，进而调节相关基因表达而提高逆境适应性[13]。水稻在低磷胁迫下，高表达基因附近转座子发生广泛性DNA超甲基化，致使其活性被抑制，并且这种甲基化改变可通过有丝分裂进行传播[14]。拟南芥研究也显示低磷胁迫诱导磷酸盐应答基因的调控元件附近的DNA发生动态的甲基化变化，影响转录因子的结合效率从而调节低磷应答基因的表达而适应逆境[15]。砷胁迫下，砷富集植物凤尾蕨叶片中砷累积量与5mC水平呈显著负相关，且影响植株的生理代谢[16]。盐胁迫诱导大豆多个转录因子家族如MYB、b-ZIP和AP2/DREB表达谱改变，且都与其基因序列的甲基化改变呈显著相关[17]。可见DNA甲基化变化已被认为是植物响应逆境胁迫的重要机制。

DNA甲基化的水平和模式与DNA脱甲基化酶活性密切相关，其是催化DNA主动脱甲基化过程的重要酶，如ROS1(Repressor of silencing 1)。对拟南芥的研究显示，AtROS1序列结构中含有EndonucleaseIII和HhH-GPD结构域，可同时发挥DNA糖基化酶(DNA glycosylase)活性和AP位点裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)活性，识别并将甲基化的胞嘧啶碱基从DNA骨架上移除，随后断开DNA骨架并移除脱氧核糖，最后该位点被未甲基化的胞嘧啶修复，完成脱甲基化过程[8,18-19]。ROS1基因敲除可导致拟南芥基因组DNA超甲基化，致使敲除突变体对胁迫应答激素ABA的敏感性增加，表明了ROS1基因诱导的DNA脱甲基化行为在胁迫应答中的重要作用[20]。

在对拟南芥的AtROS1蛋白序列进行同源比对时发现，大豆体内含有其同源蛋白的多个拷贝，生物信息学分析显示其均含有DNA_glycosylase、HhH-GDP_domain和HTH_base_excis_C结构域，表明这些同源蛋白可能都具有去除DNA分子上甲基的功能[21]。高分辨率的大豆基因组DNA甲基化组测序结果显示，连作逆境使大豆基因组DNA发生脱甲基化，而且这一过程增强了大豆植株的连作逆境适应能力[22]。本研究克隆了大豆DNA脱甲基化酶相关基因Glyma03g34860和Glyma10g07601，并预测其互作蛋白以证实其在DNA脱甲基化中的作用，进一步通过荧光定量表达分析揭示二者与大豆抗(耐)连作的关联性，为进一步提高大豆抗(耐)连作的分子育种水平提供了表观遗传学方面的思考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大豆品种包括安达农家(ADNJ)，黑大豆(HDD)，垦丰16(KF16)，绥农14(SN14)和黑农40(HN40)，由黑龙江八一农垦大学大豆遗传育种实验室提供。连作土壤取自黑龙江省大庆市林甸县大豆连作6 a土壤，以近缘大豆玉米轮作土壤为对照。采用盆(直径25 cm，高20 cm)栽试验方法，每品种分别在连作和非连作土壤种植3盆，每盆留苗3株，于温度25℃/18℃，湿度70%的日光温室中培养60 d。剪取大豆叶片样品，液氮固定后-80℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA提取及反转录生成cDNA

Trizol法提取大豆叶片总RNA，Nanodrop测定其浓度和纯度。然后以其为模板，Oligo(dT)为引物，利用反转录试剂盒进行反转录反应，生成cDNA。反应体系及过程：在冰浴的RNase-free PCR管中加入总RNA 2 μL，Oligo(dT)(100 pmol)1 μL，dNTP Mix(0.5 mM) 1.0 μL，RNase-free ddH2O定容至14.5 μL，65℃温浴5 min后，冰浴2 min，然后离心3～5 s；将试管冰浴，再加入5×RT buffer 4.0 μL，Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor(20 U)0.5 μL，RevertAid Premium Reverse Transcriptase(200 U)1.0 μL，轻轻混匀后离心3～5 s，然后在PCR仪上25℃孵育10 min,50℃ cDNA合成30 min,85℃ 5 min终止反应，-20℃保存备用。

1.3 引物设计与基因克隆

在大豆基因组数据库Phytozome v12.1.6(https:

//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中分别输入关键词Glyma03g34860和Glyma10g07601，查阅基因的CDS序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物。Glyma03g34860的引物序列为F：5'-ATGGAGGTTGGAGAAACAGAG-3'；R：5'-TCAGGATCCTCCGGTCTGCCG-3'，拟扩增基因大小5 226 bp。Glyma10g07601的引物序列为F：5'-ATGGAGGTTGGGGAAATGGAC-3'；R：5'-TCATTTGTCTCTGTTGGCAATC-3'，拟扩增基因大小6 045 bp。以反转录生成的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR反应。反应体系为：cDNA模板2 μL，TransStart© FastPfuFly DNA聚合酶1 μL，5×PCR buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 36 μL。PCR扩增条件为95℃预变性2 min,95℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸90 s，40个循环；72℃延伸5 min。

1.4 测序鉴定

采用1 g·L-1的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，利用胶回收试剂盒回收所扩增基因片段，70℃ 30 min进行加A反应，将加A的目的片段与载体pMD18-T于16℃过夜连接，然后转化DH5α感受态细胞，涂板，37℃培养过夜。对菌落PCR验证阳性的转化子进行LB液体培养，提取质粒，寄送华大生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.5 互作蛋白预测分析

互作蛋白预测分析采用STRING(http://www.string-db.org)在线软件进行[23-24]。分别输入Glyma03g34860和Glyma10g07601的氨基酸序列，物种选择大豆，搜索数据设置为只搜索数据库内容或者实验证实的互作关系，最低得分设置为0.40(中等置信度)。

1.6 qRT-PCR

qRT-PCR反应利用ABI Stepone plus型荧光定量PCR仪进行。内参基因设为Actin，引物序列为ACT-F：5'-GACCTTCAACACCCCTGCT-3';ACT-R：5'-GTGGGAGTGCATAACCCTC-3'，扩增片段大小为143 bp。Glyma03g34860基因引物序列为F：5'-TGGGAAGATGAACGAAATGTG-3'；R：5'-AACTGGAAAGATGGTCCGAGA-3'，扩增片段大小为163 bp。Glyma10g07601基因引物序列为F：5'-GGTCATCGTTCCCTTTCACAT-3'；R：5'-TCGTTCTTCTTCCCACCACTT-3';扩增片段大小为160 bp。

分别以大豆品种ADNJ、HDD、HN40、SN14、KF16的总RNA反转录生成的cDNA为模板进行qPCR反应。反应体系为SybrGreen qPCR Master Mix(2×)10 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，cDNA 模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。循环条件为：95℃预变性3 min，95℃变性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，45个循环。相对表达量通过计算2-(ΔΔCt)的值表示，其中ΔCt=(Ct测定基因-Ct内参基因)，ΔΔCt=(ΔCt连作条件-ΔCt非连作条件)。

1.7 数据分析

统计分析采用SPSS 25.0软件进行，P值小于0.05认为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 大豆DNA脱甲基化酶相关基因的克隆

以大豆叶片组织cDNA为模板，利用高保真DNA聚合酶进行Glyma03g34860和Glyma10g07601基因的PCR扩增。根据在大豆数据库Phytozome v12.1.6中比对结果，Glyma03g34860的CDS序列为5 226 bp，Glyma10g07601的CDS序列为6 045 bp。电泳结果显示所扩增片段大小与预期基因大小相似(图1)。

切胶回收Glyma03g34860和Glyma10g07601基因，将其与pMD18-T连接，转化DH5α感受态细胞，分别挑取16个单菌落进行菌落PCR检测，结果显示分别有3个阳性克隆，表明在这些菌株中重组质粒转化成功。挑取PCR验证阳性的转化子摇菌培养，提取质粒后进行测序反应，将测序结果与GeneBank数据库中的基因序列进行比对，结果显示克隆基因序列Glyma03g34860和Glyma10g07601分别存在3处点突变，这可能是因为目的基因序列太长，即使高保真聚合酶也难免出现错配。分别对这2个基因的TA克隆重组子进行了点突变回复，然后测序验证得到完全正确的基因序列。

2.2 大豆脱甲基酶Glyma03g34860和Glyma10g07601的互作蛋白分析

根据大豆数据库，Glyma03g34860蛋白的氨基酸数目为1 741个，Glyma10g07601蛋白的氨基酸数目为2 014个。利用STRING在线软件分别对与Glyma03g34860和Glyma10g07601互作的蛋白质进行预测，发现二者的互作蛋白完全相同，表明这2个蛋白在细胞内的作用可能完全相同。主要的互作蛋白有8个，其中1个DNA-AP位点裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)Glyma04g36610.4，2个DNA依赖的RNA聚合酶亚基Glyma13g26691.2和Glyma15g37710.1，2个HSP20家族蛋白，3个未知蛋白(图2)。

进一步比对这2个蛋白质的氨基酸序列，发现其序列相似性(Identity)为62%，且其相似性序列主要位于HhH-GPD_domain，HTH_base_excis_C和DNA_glycosylase 3个可能的结构域区域，相似性分别为91.07%，97.14%和63.98%。并且这两个蛋白的保守位点(Conserved site)为EndonucleaseIII_FeS-loop_motif，这些结构域赋予了蛋白质碱基切除修复(Base-excision repair)和DNA 修复(DNA repair)的功能，这与InterPro在线网站GO预测分析的这2个蛋白参与的生物学过程一致。

2.3 Glyma03g34860和Glyma10g07601基因表达量分析

以Actin为内参基因，通过qPCR方法检测了Glyma03g34860和Glyma10g07601基因在安达农家(ADNJ)、黑大豆(HDD)、垦丰16(KF16)、绥农14(SN14)和黑农40(HN40)5个大豆品种中的表达水平，结果如图3所示。在连作条件下，2个基因在检测的5个品种中表达均升高。其中，Glyma10g07601基因在ADNJ、HDD、SN14和HN40品种达显著水平(P<0.05)，分别增加1.37、1.22、1.98倍和1.67倍；Glyma03g34860基因在KF16、SN14品种达显著水平(P<0.05)，分别增加1.62倍和1.65倍。该结果表明，在连作胁迫下，Glyma03g34860和Glyma10g07601至少有1个的表达会显著升高，参与连作逆境的应答。

3 讨 论

植物体内DNA甲基化的状态并不是固定不变的，其复杂的调节过程与DNA脱甲基化酶的表达活性密切相关。由DNA脱甲基化酶发挥作用而清除DNA上的甲基标记的过程称为主动脱甲基化[25]。DNA脱甲基化酶是一种双功能酶，具有DNA糖基化酶(DNA glycosylase)活性和AP位点裂解酶(Apurinic or apyrimidinic site lyase)活性，其对DNA序列的作用具有一定的偏好性。Tang等[26]对拟南芥脱甲基化酶AtROS1的研究表明，ROS1主要通过作用于近蛋白编码基因的转座子(Transposable elements，TEs)和基因间隔区，从而阻止DNA的甲基化传播至其临近的基因。

Glyma03g34860和Glyma10g07601是与拟南芥AtROS1同源的大豆DNA脱甲基化酶。生物信息学分析显示二者都兼具有DNA糖基化酶活性和AP位点裂解酶活性，因此可能参与了大豆DNA脱甲基化过程[21]。本研究中，5个大豆品种的Glyma03g34860和Glyma10g07601在连作综合逆境胁迫下表达量均增加，且每个品种至少有一个基因的表达显著增加，暗示了其表达增加可加强植株脱甲基化能力而使基因组DNA处于脱甲基化状态，从而上调某些抗性基因的表达使大豆植株适应连作综合逆境胁迫。

本研究中的互作蛋白预测结果显示，Glyma03g34860和Glyma10g07601具有相同种类和功能的互作蛋白质，证明了二者在功能上的一致性。在互作蛋白中包含一个DNA-AP位点裂解酶Glyma04g36610.4，其是参与DNA的脱甲基化反应所必需的酶。而且Glyma03g34860和Glyma10g07601本身也具有HhH-GPD_domain，HTH_base_excis_C和DNA_glycosylase结构域及保守的EndonucleaseIII_FeS-loop_motif，因此在互作蛋白的帮助下是可以完成DNA脱甲基化反应过程的[18, 27]。另外在互作蛋白中还包含两个RNA聚合酶亚基Glyma13g26691.2和Glyma15g37710.1，表明DNA脱甲基化酶在执行功能时可能与某些RNA聚合酶相互作用。大量研究已经证实DNA的甲基化和脱甲基化过程均与由植物特异性的RNA聚合酶-Pol Ⅳ和Pol Ⅴ催化产生的非编码RNA分子密切相关[28-29]。而且，DNA脱甲基化会促进某些基因的转录[20]，那么参与这两个过程的蛋白或酶之间存在某种关联或相互作用也是可能的，然而目前并没有相关文献直接证实二者之间的相互作用。通过互作蛋白的预测分析可以部分解释脱甲基化酶相关蛋白Glyma03g34860和Glyma10g07601在大豆植株抵抗连作胁迫中的作用，然而这些建立在网站预测基础上的结果的可靠性还有待于在后续的试验中通过酵母双杂交、免疫共沉淀或GST-pulldown等蛋白互作试验进一步证实。