宫春宇 ,邢悦,刘羽婷,徐硕,余世锋
1. 齐齐哈尔大学食品与生物工程学院(齐齐哈尔 161006);2. 黑龙江省果蔬杂粮饮品工程技术研究中心(齐齐哈尔 161006)
玉米须(Stigma maydis)是禾本科的一年生草本植物玉米(Zea maysL.)的花柱和柱头,是玉米生产的主要副产品之一。在我国,玉米须是一味常用中药药材[1],安全无毒[2],在美国等其他国家也被广泛应用[3]。中国民间常将玉米须泡水饮用,典籍记载其具有清热解毒、利尿、降糖等功效[4]。玉米须的促健康作用源于其含有丰富的活性物质,其富含多糖、黄酮、多酚、绿原酸等。其中,以黄酮、多酚等为代表的活性物质具有良好抗氧化性。研究显示,人的衰老、心血管疾病和癌症等一些重要的生理过程和疾病均与自由基的氧化破坏作用有密切关系。人体新陈代谢过程中产生的具有孤对电子的基团,被称为自由基。大量文献报道自由基对健康有巨大破坏作用,因此开发天然的自由基清除剂成为许多研究的目标。玉米须因资源丰富又富含抗氧化物质受到关注,报道显示玉米须多酚和黄酮类对DPPH自由基、超氧自由基、羟自由基和ABTS自由基均具有较好的清除作用[5-10]。但有研究在进行自由基清除试验时,测试样品实际为玉米须总提取物,其效果为所有具有抗氧化作用的物质的综合效应,代表的是提取物的总体清除自由基能力,而如何高效制备玉米须中总抗氧化物质未见详细报导。关于玉米须中总抗氧化物质提取率与活性之间关系研究也未见报导。因此,试验以抗氧化物质提取较佳的乙醇[6]作为浸提溶剂,探究玉米须中抗氧化物质的提取工艺,考察液料比、提取温度、提取时间、乙醇体积分数和提取次数对抗氧化物质提取的影响,研究不同提取率的玉米须抗氧化物质的清除自由基活性,为玉米须的全面开发奠定坚实基础。
1.1.1 原料
玉米须:成熟玉米须,清洗后干燥,粉碎至0.3mm以下,阴凉处保存备用。
1.1.2 主要试剂
DPPH(1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基,分析纯,Sigma公司);乙醇、硫酸亚铁等(均为国产分析纯)。
1.1.3 主要仪器与设备
BS223S分析天平(北京赛多利仪器系统有限公司);722分光光度计(上海欣茂仪器有限公司);HH-S水域锅(巩义市予华仪器有限责任公司);101-2B电热鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)。
1.2.1 玉米须乙醇提取方法
1.2.1.1 室温浸泡提取
取30.0 g脱脂玉米须粉于三角瓶或烧杯中,添加240 mL无水乙醇溶液(8 mL/g),室温提取1 d(每间隔一段时间摇动1次)后,减压过滤分离提取清液。提取清液经旋转蒸发浓缩后,干燥至恒质量。提取率按式(1)计算。
1.2.1.2 热回流提取
称取30.00 g脱脂玉米须粉于提取瓶,添加240 mL无水乙醇溶液(8 mL/g),于85 ℃水域回流提取60 min,待冷却后,减压过滤分离提取清液。提取清液经旋转蒸发浓缩后,干燥至恒质量,计算提取率。
1.2.2 玉米须热回流醇提工艺单因素试验
采用热回流提取方法,见1.2.1。考察乙醇体积分数、提取时间、液料比、提取温度和提取次数对提取率的影响,单因素试验见表1。
表1 提取工艺因素水平表
1.2.3 响应面法优化
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,结合单因素试验结果,选取乙醇体积分数、液料比和提取次数3个影响较大因素,运用Design Expert 8.0.6软件设计三因素三水平的响应面试验,并对结果进行分析。因素水平设计见表2。
表2 中心组合试验Box-Behnken设计因素和水平编码值
1.2.4 DPPH自由基清除率的测定
参照Saiga等[11]方法测定,并略作修改。准确吸取2 mL样品液于具塞试管中,加入2 mL DPPH溶液(浓度0.1 mmol/L,溶剂为无水乙醇),摇匀,在室温下避光静置30 min,以蒸馏水调零,517 nm波长下测定吸光度A。阳性对照为VC(10 μg/mL),根据式(2)计算DPPH自由基的清除率。
式中:P为DPPH自由基清除率,%;A0为空白的吸光度,80%乙醇替代样品;A1为样品的吸光度;A2为样品背景值的吸光度,80%乙醇替代DPPH。
1.2.5 羟自由基清除率的测定
羟自由基清除能力的测定参考Fenton反应的方法并略作修改[12]。依次加入3 mL蒸馏水、1 mL 6 mmol/L硫酸亚铁溶液、1 mL 6 mmol/L水杨酸乙醇溶液和2mL样品溶液,摇匀静置10 min,加入1 mL 6 mmol/L过氧化氢溶液,摇匀,于37 ℃水浴30 min,在波长510 nm处以蒸馏水调零。测定吸光度A。阳性对照为VC(300 μg/mL)。羟自由基清除率按式(3)计算。
式中:P为羟自由基清除率,%;A0为空白的吸光度,80%乙醇替代样品;A1为样品的吸光度;A2为样品背景值的吸光度,蒸馏水替代6 mmol/L过氧化氢。
2.1.1 提取时间
由图1可见,随着提取时间增加,玉米须中抗氧化物质的提取率呈现先快速升高后略微降低趋势。提取90 min时,抗氧化物质的提取率最高。玉米须中抗氧化物质主要是以黄酮和多酚类等为代表的含有不饱和键的一类物质,其稳定性不是很好,容易在提取过程中被氧化破坏或发生其他反应而导致提取物减少,这可能是导致其90 min以后提取率略有下降的原因。另外,提取时间直接关系到实际生产中的效率和成本,一般在能保证提取率的前提下,会选择较短的提取时间,用于生产。因此,选择提取时间90 min比较适合。
图1 提取时间对玉米须抗氧化物质提取率的影响
2.1.2 液料比
液料比通常对物质的提取有较大影响[13],提取溶剂用量增加能有效稀释溶质,扩大原料内外溶质浓度差,增加渗透压,有利于溶质的浸出。由图2可知,液料比15∶1 mL/g比5∶1和10∶1 mL/g提取率提高20%左右,可见溶剂用量少不利于玉米须中抗氧化物质的浸提;但继续增加溶剂用量对提取率的提高有限。综合考虑成本和提取率等因素,选择液料比15∶1~25∶1 mL/g比较适合。
图2 液料比对玉米须抗氧化物质提取的影响
2.1.3 提取次数
由图3可见,提取次数对玉米须中抗氧化物质提取的影响比较大,提取3次比只提取1次,提取率提高49%,这可能与试验中提取液料比8∶1 mL/g有关,由于溶剂用量比较少,使得溶质残留相对较多,所以增加提取次数对提取率的影响被放大,推测如改用较大的液料比,可能提取次数的影响会降低。综合分析和成本等因素,下周提取2~3次较适合。
图3 提取次数对玉米须抗氧化物质提取的影响
2.1.4 提取温度
由图4可以看出,提高提取温度能增加抗氧化物质的提取率,但相对于提取次数和液料比,提取温度对抗氧化物质的浸出影响比较小。在室温(约25 ℃)下提取,结果发现采用高温提取比室温提取得到的抗氧化物质的提取率提高28%。因此,考虑到在保证较高提取率前提下尽量节能和降成本,选择提取温度60 ℃。
2.1.5 乙醇体积分数
图5显示,提取溶剂乙醇体积分数对提取有非常大的影响,体积分数由40%增加到100%,提取率先快速上升,后趋于平稳,再迅速下降。可见,乙醇体积分数过低和无水乙醇均不适合作为提取溶剂,故选择乙醇体积分数70%~80%较为合适。
图4 提取温度对玉米须抗氧化物质提取的影响
图5 乙醇体积分数对玉米须抗氧化物质提取的影响
响应面优化试验结果见表3。
表3 响应面试验设计及结果
经Design Expert 8.0.6进行回归分析和拟合,得到回归方程:Y=3.548+0.138 75X1+0.112 5X2+0.308 8X3-0.03XX-0.012 5XX-0.04XX+0.002 3X2-0.025 3X2-121323120.112 8X2。3
由表4可知,模型的p<0.01,说明该模拟回归二次方程极显著,可用于模拟分析和预测玉米须中抗氧化物质的提取。模型失拟项p=0.224 7>0.05,相关系数R2=0.968 6,说明回归方程拟合度良好,预测效果比较好。回归系数显著性分析显示,一次项X1乙醇体积分数、X2液料比和X3提取次数的p<0.01,对提取率的影响极显著,二次项X32的p<0.05,影响显著。可见,回归分析中3个试验因素对抗氧化物质提取率的影响不是简单的线性关系,二次项对提取率有一定影响,但试验因素间没有明显交互作用。回归方程一次项的回归系数大小依次为X3>X1>X2,表明提取次数对玉米须中抗氧化物质的提取率影响最大,其次是乙醇体积分数和液料比。经Design Expert 8.0.6软件分析,最佳提取条件为乙醇体积分数80%、液料比24∶1 mL/g、提取次数3次。在此条件下,预测的提取率为3.80%。进行验证试验,3次平行的平均提取率为3.72%,与理论值相差0.08个百分点,表明利用该拟合方程对玉米须中抗氧化物质的提取进行预测是可行的,回归方程具有实际应用价值。
表4 回归方程方差分析表
为考察不同提取率的玉米须抗氧化物质对自由基清除活性的影响,研究中选取提取次数单因素试验中提取率相差较大的提取1次(得率1.94%)、提取2次(2.52%)和提取3次(2.89%)样品进行自由基清除试验。
图6显示,3个不同提取率的样品在100~600 μg/mL质量浓度范围内随着浓度升高,其对DPPH自由基的清除作用显著增强,呈现剂量依赖,表明乙醇提取获得的玉米须抗氧化物质对DPPH自由基有良好的清除作用。在100,300和600 μg/mL质量浓度下,3个样品之间的清除效果没有差异,说明提取率升高不会降低提取物对DPPH自由基的清除活性。
图6 不同提取率玉米须抗氧化物质对DPPH自由基清除作用
羟自由基清除试验结果见图7。不同提取率的玉米须抗氧化物质对羟自由基的清除效果同对DPPH自由基清除效果趋势一致,在1~5 mg/mL质量浓度范围内随着浓度升高,其对羟自由基的清除作用均显著增强,呈现剂量依赖,只是对羟自由基的清除比DPPH自由基需要更高浓度。在1,3和5 mg/mL质量浓度下,3个样品之间的清除效果没有差异,表明提取率升高不会降低对羟自由基的清除活性。综合DPPH自由基和羟自由基清除试验结果,玉米须抗氧化物质提取率的升高不会降低其对自由基的清除活性,而在实际的生产中,提取率越高代表收益越高,这正是产品研发的最终目标之一。
图7 不同提取率玉米须抗氧化物质对羟自由基清除作用
乙醇体积分数、提取次数和液料比3个因素对玉米须中抗氧化物质的提取影响比较大,其中提取次数>乙醇体积分数>液料比,而提取温度和提取时间的影响相对较小。最佳提取工艺为乙醇体积分数80%,液料比24∶1 mL/g,提取温度60 ℃、提取时间90 min,提取次数3次。乙醇提取获得的玉米须抗氧化物质在100~600 μg/mL质量浓度范围内可以清除DPPH自由基,在1~5 mg/mL时可清除羟自由基,且均表现出剂量依赖,表明其具有良好的自由基清除活性。
玉米须中抗氧化物质提取率升高不影响其对DPPH自由基和羟自由基的清除活性。