慢性肾脏病血管钙化大鼠并发心肌炎性反应

袁 玲，聂 卫，王 蕾，王 宏，崔晓雪，刘琳娜

(天津市医药科学研究所 1.病理室； 2.心脑血管药物研发中心，天津 300020；3.中山市中医院 肾内科，广东 中山 528401)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)患者最常见的严重并发症之一，占尿毒症患者总病死率的50%。肾功能不全患者，心血管事件的病死率比一般人群高30倍，是肾功能不全患者最主要的死亡原因，而血管、心瓣膜的钙化和心肌病变又是导致终末期肾病患者CVD的主要原因[1-4]。

血管钙化(vascular calcification，VC)是 CKD 患者心血管疾病发病率和病死率增加的主要危险因素[5]。腺嘌呤诱导的CKD肾脏病理形态和生化都接近/模拟于临床病理状态，故常用于诱导CKD/CKD-VC，异常高浓度的腺嘌呤转变为极难溶于水的2,8-二羟基腺嘌呤，沉积于肾小管与肾间质部位造成肾损害，为缩短试验周期，常采用腺嘌呤加高磷饮食的造模方法构建CKD血管钙化模型。

目前对CKD并发血管和心瓣膜的钙化的研究相对较多，而对CKD并发心肌病变的研究较少。因此，本研究观察了该造模方法诱导大鼠肾损害和血管钙化的同时造成的心肌炎性损害，以期对CKD晚期并发CVD的全面研究提供必要的补充。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性Wistar大鼠32 只，体质量(160～180)g[北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006]。

1.1.2 实验药物和试剂：腺嘌呤(10 mg/片，天津力生制药股份有限公司生产)，磷酸二氢钠(天津市风船化学试剂科技有限公司)；兔抗鼠TNF-α多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)；兔抗鼠TLR4多克隆抗体、兔抗鼠IL-6多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的链菌素抗生物素(武汉博士德生物技术有限公司)；von Kossa染色试剂盒(上海经科化学科技有限公司)；Masson染色试剂盒(天津鼎国生物技术有限责任公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组及处理：将大鼠分为对照组及CKD-VC组(每日1次灌胃给予腺嘌呤200 mg/kg +高磷饮水)，每组16只，对照组给予普通饮水，CKD-VC组给予高磷饮水(0.5 g/只，2.5 g溶入500 mL饮用水中)，连续 10 周。5 周末每组剖杀6只动物，10 周末处死全部动物，经腹主动脉取血，摘取肾脏、心脏及胸主动脉进行病理组织学观察。

1.2.2 检测血常规： MEK-7222全自动血细胞分析仪检测 5 周血白细胞及分类。

1.2.3 检测肾功能及钙磷代谢：日立7080全自动生化仪测定 10 周血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)、磷(P)和钙(Ca)水平。

1.2.4 HE 染色及病理组织学观察： 5 周和 10 周摘取的肾脏、心脏和主动脉经10%甲醛固定，常规脱水包埋，制成切片，进行HE染色。

1.2.5 Masson染色检测 10 周肾纤维化：肾脏切片脱蜡至水洗，按试剂盒说明进行Masson染色。

1.2.6 von Kossa染色检测 10 周胸主动脉钙化：主动脉切片脱蜡至水洗，按试剂盒说明进行von Kossa 染色。

1.2.7 免疫组织化学染色法检测10周心脏组织TLR4、IL-6、TNF-α的表达：组织切片脱蜡水化，3% H2O2封闭过氧化物酶10 min，TBS冲洗，微波炉内抗原修复10 min，取出冷却至室温，分别加入浓度为1∶100的相应一抗，4 ℃ 过夜后，依次滴加二抗和SP复合物，各37 ℃ 30 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。以TBS代替一抗设立阴性对照。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 动物一般情况

10 周时正常组大鼠精神良好，活动正常，毛色光泽。CKD-VC组大鼠死亡3只，余动物毛色枯槁、散乱竖起，脱毛，懒动，排尿明显增多，体质量逐渐下降，精神较差。

2.2 血白细胞及分类

5周时CKD-VC组大鼠血嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞及淋巴细胞计数较正常组明显增多(P<0.05)(表1)。

2.3 肾功能和钙磷代谢

与正常对照组相比，10 周时CKD-VC组血清Scr和BUN水平明显升高，血清P水平升高，而Ca水平降低(P<0.01)(表2)。

表1 5 周时两组大鼠血白细胞及分类比较

2.4 肾脏病理组织学

5 周和 10 周对照组肾脏结构正常。CKD-VC组：5 周时肾间质见散在嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞浸润，可见少量纤维化；10 周时见肾小球结构紊乱，肾小管明显萎缩，伴代偿性扩张，局部见棕褐色结晶沉积，肾脏间质弥漫淋巴和单核细胞浸润，大量成纤维细胞增生，形成广泛纤维化，肾脏血管明显减少，Masson染色结果显示肾间质存在广泛蓝染的胶原纤维(图1)。

表2 10 周时两组大鼠肾功能和钙磷代谢指标比较Table 2 Comparison of serum biochemical indexes between the two groups at 10 weeks

HE staining, 5 weeks normal group showed normal, CKD-VC group showed inflammatory cell infiltration; 10 weeks normal group showed normal, CKD-VC group showed inflammatory cell infiltration and interstitial fibrosis; Masson staining,10 weeks normal group showed normal, CKD-VC group showed a large number of collagen fibers stained blue

2.5 胸主动脉病理

5 周和 10 周对照组血管结构正常。CKD-VC组：5 周时HE和von Kossa染色未观察到血管钙化；10 周时HE染色见动脉中膜存在连续性分布的钙化结节，von Kossa染色后钙化结节呈黑色，血管钙化发生率为5/7(图2)。

2.6 心脏病理组织学

5 周和 10 周对照组心脏结构正常。CKD-VC组随CKD肾脏病变进展，并发心脏炎性病变逐渐明显，5 周时 CKD-VC组1只动物心肌见少量淋巴细胞浸润；至 10 周时CKD-VC组动物心肌见多发的心肌细胞坏死灶伴炎性细胞浸润(表3，图3)。

2.7 免疫组化方法检测炎性因子TLR4、TNF-α和IL-6的表达

正常组心脏组织未见TLR4、IL-6和TNF-α表达，CKD-VC组在心肌炎性区域可见TLR4呈棕褐色的强阳性表达，核浆均有着色；IL-6和TNF-α呈棕黄色的中等程度阳性表达，着色主要在胞浆，核亦有少量表达(图4)。

3 讨论

腺嘌呤复合高磷饮水是诱导CKD-VC较为稳定的方法之一，本研究采用该方法构建出与临床近似的CKD-VC模型，其特征为肾小球硬化或萎缩，颗粒沉积物过多积累，间质纤维化，炎性细胞浸润，肾功能指标(Scr，BUN，P和Ca)表现异常，病理HE染色和von Kossa染色均在主动脉中膜发现广泛的钙化。

HE staining, normal group showed normal, CKD-VC group showed blue calcified nodules in the arterial media. von Kossa staining, the normal group showed normal, and the calcified nodules were black in the CKD-VC group

表3 10 周时两组大鼠心肾炎性反应比较Table 3 Comparison of Cardio-renal inflammatory response in the two groups of rats at 10 weeks

HE staining, 5 weeks normal group showed normal, CKD-VC group showed a single lymphocyte infiltrating the myocardium(Short arrow), 10 weeks normal group showed normal, CKD-VC group showed myocardial necrosis with inflammatory cell infiltration

图4 10 周时两组大鼠炎性因子TLR4、IL-6和TNF-α表达变化Fig 4 Expression of inflammatory factors TLR4, IL-6 and TNF-α in the two groups of rats at 10 weeks

除血管、心瓣膜的钙化以外，心肌病变也是导致终末期肾病患者CVD的主要原因。既往研究更多关注腺嘌呤导致肾损害和血管钙化，对该模型同时出现的心肌病变报道较少。本研究发现腺嘌呤复合高磷饮水处理后，随CKD肾脏病变进展，并发心脏炎性病变逐渐明显。目前的研究认为心脏-肾脏之间存在cross-talk，心脏肾脏疾病常常伴随发生，且心脏或肾脏的原发疾病会对另一器官造成损伤，这反过来也会加速原发疾病的进展[6-7]。本研究结果也观察到了心肾炎症性疾病伴随发生的现象。

Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)长期或过度激活诱导慢性低度炎性反应，导致内皮功能障碍，细胞死亡增加和不良心脏重塑，目前，对TLR4的研究最深入。本研究发现TLR4在心肌炎性区域高表达，提示TLR4炎性通路参与腺嘌呤复合高磷饮水诱导的CKD-VC心肌损害。TLR4与配体结合后，可以激活核因子-κB信号通路，调节其下游肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等炎性因子释放，加剧炎性反应[8-9]。TNF-α是一种反映炎性反应活跃度的敏感炎性因子，当机体受到损伤时，TNF-α由活化的巨噬细胞迅速分泌并释放出来，通过刺激C-反应蛋白及IL-6等炎性因子的产生介入炎性反应[10-11]。本研究发现TNF-α和IL-6在CKD-VC组心肌炎性区域高表达，与TLR4的表达相一致，提示TLR4、TNF-α和IL-6等炎性因子的激活引起了心肌炎性反应。

腺嘌呤复合高磷饮水除诱导大鼠出现肾损害和血管钙化外还诱导了心肌炎性反应，以往的研究对此报道较少。心肌炎性反应在心脏功能障碍的病理生理机制中发挥着重要作用，过度或慢性的心肌炎性反应，可引起严重的心肌损伤，可能为血管钙化以外终末期肾病患者并发CVD的又一重要因素，本研究为CKD晚期并发CVD的全面研究提供了重要的补充。