结缔组织生长因子促进人卵巢癌细胞系SKOV3增殖与迁移

董玲玲，高 云，牛国宇

(1.潍坊市中医院 肿瘤中心； 2.潍坊医学院 公共卫生与管理学院, 山东 潍坊 261000)

上皮性卵巢癌(ovarian cancer)由于侵袭性较强，大多数患者被确诊时已为晚期[1]。临床迫切需要了解卵巢癌发生发展的分子机制，并进一步确定诊断和治疗的分子标记和靶点[2]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一种属于CCN家族的分泌蛋白，参与肿瘤的增殖、迁移、血管生成和转移等[3-4]。研究发现CTGF在卵巢癌的发生发展中起到重要作用[5-6]，但具体机制不清。本研究采用rhCTGF刺激卵巢癌细胞SKOV3，观察SKOV3的增殖、迁移能力以及EMT相关蛋白的表达变化，初步探索CTGF在卵巢癌中的作用，为卵巢癌寻找新的预后标志物和分子治疗靶点提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重组人CTGF(rhCTGF)(PeproTech公司)；人卵巢癌细胞系SKOV3(山东大学齐鲁医院肿瘤中心实验室惠赠)；CCK8试剂盒(日本同仁试剂公司)；Western blot相关抗体(Bioworld公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的分组及处理:人卵巢癌细胞SKOV3培养于加双抗的含10% FBS的DMEM培养基中。置于37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱中培养, 胰蛋白酶消化传代细胞。实验组用含rhCTGF(终浓度500 mg/L)的DMEM培养基培养，对照组含同等量PBS的DMEM培养基培养。每组实验重复3次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖: 将SKOV3细胞接种在96孔板内, 5 000个/孔，第1～7天内检测。加入10% CCK8试剂后继续培养2 h，在酶标仪450 nm处检测各孔吸光度值(A)。

1.2.3 集落形成检测细胞增殖: 接种SKOV3细胞500个/孔在6孔板，每组2个复孔。一般培养14 d内。集落形成后停止培养，固定、染色、拍照。

1.2.4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力: 调整细胞密度为5.0×105个/孔接种于6孔板中，待细胞汇合度达到90%左右时，用200 μL枪头划线, PBS清洗3次。并于划线后0、24和48 h后拍照记录。

1.2.5 Western blot检测蛋白: 将SKOV3细胞接种24 h板，完全汇合后rhCTGF处理24 h，提取细胞总蛋白,测定蛋白含量,制胶、上样、电泳、转膜、洗膜，脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育4 ℃过夜，二抗室温反应2 h，ECL曝光成像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 rhCTGF促进卵巢癌SKOV3细胞增殖

rhCTGF处理后，SKOV3细胞的增殖率高于对照组(P<0.05)(图1A)。细胞培养14 d左右，实验组细胞的克隆形成能力高于对照组(P<0.05)(图1B，C)。

2.2 rhCTGF促进卵巢癌SKOV3细胞的迁移能力

与对照组相比，实验组SKOV3细胞的迁移率明显提高(P<0.05)(图2)。

2.3 rhCTGF影响EMT相关蛋白的表达

rhCTGF处理后EMT相关标志物E-cadherin蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)，而 Vimentin蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group图1 CCK8 法(A)和克隆形成实验(B,C)分别检测SKOV3细胞的增殖和克隆形成能力

*P<0.05 compared with control group图3 蛋白质印迹法检测SKOV3细胞中EMT相关蛋白的表达

3 讨论

上皮性卵巢癌是妇科肿瘤中致死性最高的恶性肿瘤。多年来，卵巢癌的治疗得到长足的进展，但晚期卵巢癌的总体生存期仍不尽人意[7]。CTGF在卵巢癌发生、发展中的作用被很多学者探索，部分学者认为它在卵巢癌的发生发展中起到抑制作用[8-9]，但近年来越来越多的证据表明它为促癌因子[10-11]。本研究利用外源性rhCTGF处理卵巢癌细胞SKOV3后细胞增殖及迁移能力明显增强，E-cadherin表达下调，Vimentin的表达上调。综上可见，CTGF可能通过诱导EMT促进卵巢癌细胞的增殖和迁移，有望成为上皮性卵巢癌新的预后标记及分子靶向治疗研究的新方向。