Foxp3 mRNA和SCCA联合检测对宫颈癌的诊断价值*

张 伟 蔡小凤 汪宏良 胡 芳 朱杰稳 肖 苏

宫颈癌是女性常见的生殖道恶性肿瘤，近年来发病率逐渐增高，且有年轻化趋势[1]。Foxp3不仅在调节性T细胞(Treg)的发育和功能完善中起重要调节与转导作用，在肿瘤发生发展及与 Treg 相关的免疫机制中也有重要意义[2,3]，作为肿瘤分子标志物，其与鳞状细胞癌抗原(SCCA)、糖类抗原CA50、CA125等肿瘤标志物在诊断宫颈癌中的应用，尤其联合应用研究受到临床较广泛重视[4,5]。本文报道这四种标志物在宫颈癌患者的外周血液水平变化以及Foxp3 mRNA联合SCCA检测对宫颈癌的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 对象和分组

2018-12-2020-03在本院住院的宫颈癌患者92例(宫颈癌组)，年龄47-69(57.13±9.14)岁，均经手术组织病理诊断：I期17例，II期29例，III期37例，IV期9例；鳞癌69例，腺癌17例，腺鳞癌6例；术前均未行放、化疗；排除合并其它妇科恶性肿瘤、自身免疫性疾病及严重心、肾、肝功能不全患者。同期87例体检健康女性为对照组，年龄45-72岁，平均58.3±11.9岁。两组年龄差异无统计学意义(t=3.08,P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准(批准文号：2017—JYK-001)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器和试剂

基因扩增检测系统(ABI7500型)购自美国应用生物系统公司，分子杂交仪(LF-III型)购自上海比朗仪器制造有限公司，全自动化学发光免疫分析仪(MAGLUMI 8000)购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司。总RNA提取试剂盒(批号：2019001)、RNA纯化试剂盒(批号：20190102)、cDNA合成试剂盒(批号：2019100010)、热启动荧光定量PCR核心试剂盒(批号：001252016)由武汉百翌博科技有限公司提供，Foxp3基因、内参基因β肌动蛋白(β-actin)引物由宝生物工程(大连)有限公司合成(引物序列见表1)，SCCA、CA50、CA125检测试剂盒均购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司，批号分别为0631900602、0371900402、0241900506。

表1 检测基因与对应的引物序列

1.3 检测指标和方法

宫颈癌组患者于手术前、对照组于同一时期，均避开月经期或孕产期，平行采集两组受试者清晨空腹肘前静脉血8ml,其中3ml EDTA-K2抗凝检测Foxp3mRNA相对表达水平，余5ml不抗凝，检测血清SCCA、CA50、CA125水平。

1.3.1Foxp3 mRNA检测 6小时内用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取单个核细胞；提取总RNA，紫外分光光度仪测定RNA浓度，利用A260/A280比值(R)判断RNA纯度(1.8-2.0)；逆转录合成cDNA，按试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR。获取PCR Ct值后，根据公式2-△Ct计算相对表达量。

1.3.2SCCA、CA50、CA125检测：将5ml非抗凝血，3 000r/min离心10min，分离血清后应用化学发光分析仪和原装配套试剂，严格按照相关说明检测SCCA、CA50、CA125浓度。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 两组Foxp3 mRNA、SCCA、CA50、CA125水平比较

宫颈癌组Foxp3mRNA、SCCA、CA50、CA125水平均明显高于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 两组Foxp3 mRNA、SCCA、CA50、CA125水平比较

2.2 Foxp3 mRNA水平与SCCA、CA50、CA125水平的相关性

宫颈癌患者Foxp3 mRNA相对表达水平与SCCA呈正相关(r=0.577,P<0.05),与CA50和CA125无明显相关(r=0.013和0.085,均P>0.05)，见图1。

2.3 Foxp3 mRNA联合SCCA诊断宫颈癌效能

ROC曲线分析结果显示，外周血 Foxp3 mRNA相对表达水平12.325为最佳截断值，其诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)为0.839(95%CI：0.707—0.907，P<0.05)，灵敏度为84.70%，特异度为74.50%；血清SCCA浓度11.72ng/mL为最佳截断值，其诊断宫颈癌的AUC为0.745(95%CI：0.697—0.899，P<0.05)，灵敏度为84.10%，特异度为78.50%；外周血Foxp3 mRNA联合血清SCCA诊断宫颈癌的AUC为0.911(95%CI：0.760—0.995，P<0.05)，灵敏度为93.10%，特异度为84.70%。见图2。

3 讨 论

Treg是重要的免疫抑制细胞，可多向调节、抑制其它T细胞活化，阻碍免疫系统对肿瘤的监视及肿瘤相关抗原-抗体的有效免疫应答，为肿瘤细胞的免疫逃逸提供有利环境，促进肿瘤进展[6]。Treg特异性高表达转录因子Foxp3蛋白在宫颈间质组织中定位于T细胞的细胞核，而在宫颈癌细胞中表达于细胞浆，通过抑制肿瘤间质T细胞活化和机体免疫反应，使宫颈癌细胞发生逃逸，该作用可能与Foxp3直接抑制了T细胞的两个关键转录因子—活化 T 细胞核因子(NFAT)和核因子κB(NF-κB)的活性有关[7-9]。这种抑制性调节作用还可能随着肿瘤恶性分化程度加重而加剧。SCCA、CA50、CA125是诊断宫颈癌疾病常用的标志物，其增高程度与肿瘤分级相关，其中SCCA与宫颈癌关系最为密切，但敏感度与特异度不高[10-14]。

图1 Foxp3 mRNA的相对表达量与SCCA、CA50和CA125相关性散点图

图2 Foxp3 mRNA联合SCCA诊断宫颈癌的ROC曲线

本文观察到，宫颈癌患者外周血Foxp3 mRNA相对表达水平及血清SCCA、CA50、CA125浓度均高于对照组,且Foxp3 mRNA相对表达水平与SCCA呈显著正相关，而与CA50、CA125无明显相关性，表明Foxp3 mRNA、SCCA与宫颈癌关系密切。进一步ROC曲线分析显示Foxp3 mRNA联合SCCA诊断宫颈癌的AUC为0.911，敏感度为93.10%，特异度为84.70%，明显高于Foxp3或SCCA单独检测的AUC和敏感度、特异度，提示Foxp3联合SCCA对宫颈癌有较高诊断效能，可供临床选择应用。