卵巢癌患者miR-497、miR-125a-5p的表达及与其临床特征和生存率的关系

闫凤洁 姚满红 耿会欣 汪 莹 高丹丽

卵巢癌是临床常见的一种妇科恶性肿瘤，超过70%的患者发现时已处于晚期，5年生存率仅为20%-30%，且治疗后易复发，而早期卵巢癌患者经治疗后的生存率则高达90%[1]。近年来，大量研究证实微小RNA(microRNA，miRNA)参与肿瘤的重要生物学过程，与肿瘤的发生发展有着紧密的联系。微小RNA-497(miR-497)是miR-15家族的成员，在多种肿瘤如肝癌、乳腺癌中表达下调，可能起抑癌基因的作用[2]。微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)近年来备受关注，研究表明，miR-125a-5p能够抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，从而对肿瘤起到抑制作用，miR-125a-5p的表达通常随细胞分化而增加，而在某些肿瘤中表达下调，如结肠癌、宫颈癌等[3]。以往研究表明，miR-497和miR-125a-5p均参与了肿瘤的发生发展，但其对卵巢癌的影响并不清楚，本研究将通过探讨卵巢癌中miR-497与miR-125a-5p的表达情况，以期为二者在卵巢癌预后中的作用提供支持。

1 资料与方法

1.1 研究对象和分组

选取2018-06-2019-12在本院进行手术治疗的96例卵巢癌患者作为研究对象，年龄35-72岁，平均55.37±8.64岁；将手术切除的卵巢癌组织作为试验组，癌旁(>2cm)正常组织为对照组，所有患者均经病理诊断确诊为卵巢癌。按照2012年国际妇产科联盟(FIGO)的分期标准[4]：Ⅰ期(10例)为肿瘤局限于卵巢或输卵管；Ⅱ期(21例)为肿瘤累及一侧或双侧卵巢或输卵管并有盆腔扩散或原发性腹膜癌；Ⅲ期(47例)为肿瘤累及单侧或双侧卵巢、输卵管或原发性腹膜癌，伴有细胞学或组织学证实的盆腔外腹膜转移或证实存在腹膜后淋巴结转移；Ⅳ期(18例)为超出腹腔外的远处转移。病理类型：浆液性癌58例，透明性癌25例，黏液性癌13例。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：(1)初发卵巢癌患者；(2)既往无其它恶性肿瘤病史；(3)临床资料及随访资料完整。排除标准：(1)自身免疫性疾病者；(2)心脏疾病者；(3)严重高血压者；(4)妊娠期孕妇。

1.3 主要试剂与仪器

RNA提取试剂盒(货号：12183025)及反转录试剂盒(货号：KR116)均购自于北京天根生化有限公司；qRT-PCR试剂盒(货号：204141)购自德国QIAGEN公司；Bio-Rad PCR仪(型号：T100)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。

1.4 检测指标和方法

1.4.1样品采集：手术切除后的离体组织(瘤组织和癌旁正常组织)在剔除肉眼可见的肌肉、脂肪及坏死组织后，将样本置于-80℃冰箱备用。

1.4.2qRT-PCR 法测定卵巢癌组织中 miR-497、miR-125a-5p的表达：从-80℃取出卵巢癌组织和癌旁正常组织，提取组织总RNA：将样本超声匀浆，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA纯度，并用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整度。逆转录反应：将所得RNA用反转录试剂盒反转录为cDNA，严格按照说明书进行操作，产物置于-20℃冰箱保存备用。qRT-PCR：反应体系20μl，10μl 2×SYBR Mix，上下游引物各1μl(均为10μm)，cDNA模板1μl，H2O 7μl，每个样品做3个重复，反应条件为95℃ 30s，95℃ 10s、60℃ 30s，30个循环，72℃延伸 10min，在荧光定量PCR仪上进行反应。其中miR-497上游引物为：5 ’-CGC CAG CAG CAC ACT GTG G-3’，下游引物为：5’-GTG CAG GGT CCG AGG T-3’；miR-125a-5p上游引物为：5'-CCG TCC CTG AGA CCC TTT AAC-3'，下游引物为：5'-GTG CAG GGT CCG AGG TAT TC-3'。二者均以U6为内参，U6的上游引物为：5'-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3'，下游引物为：5'-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3'。根据各样本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-497和miR-125a-5p的相对表达量。

1.5 术后随访

术后对患者进行随访，时间为3年，从手术日期开始计算，统计患者生存情况。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 试验组与对照组miR-497、miR-125a-5p表达水平的比较

试验组miR-497和miR-125a-5p的表达量明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 两组miR-497、miR-125a-5p的表达情况

2.2 卵巢癌患者miR-497、miR-125a-5p表达与临床病理特征的关系

卵巢癌患者癌组织中miR-497和miR-125a-5p的表达水平与年龄、病理类型及绝经状况无关(P>0.05)；与Ⅰ-Ⅱ期相比，Ⅲ-Ⅳ期miR-497、miR-125a-5p表达水平均较低(P<0.01)，与无淋巴结转移相比，淋巴结转移者miR-497、miR-125a-5p表达水平均较低(P<0.05)。见表2。

表2 卵巢癌患者miR-497、miR-125a-5p表达与临床病理特征的关系

2.3 卵巢癌患者三年生存率与miR-497、miR-125a-5p表达水平的关系

对96例卵巢癌患者进行为期3年的随访，其中68例生存，28例死亡，生存率为70.83%；将miR-497和miR-125a-5p以其表达的中位值分为两组，高于中位值者为高表达组，低于中位值者为低表达组。miR-497低表达组3年生存率为58.14%(25/43)，高表达组3年生存率为81.13%(43/53)，两组比较logrank值为6.374，P=0.012；miR-125a-5p低表达组3年生存率为57.78%(26/45)，高表达组3年生存率为82.35(42/51)，两组比较logrank值为6.832，P=0.009。见图1、图2。

2.4 影响卵巢癌患者生存的多因素分析

将卵巢癌患者术后是否死亡作为因变量，以miR-497、miR-125a-5p、临床病理分期和淋巴结转移作为水平自变量进行COX回归分析，单因素分析显示，miR-497、miR-125a-5p、临床病理分期和淋巴结转移均是影响卵巢癌患者生存率的因素，多因素分析显示，miR-497低表达及miR-125a-5p低表达是影响卵巢癌患者生存率的独立危险因素。见表3。

图1 miR-497表达与卵巢癌患者术后3年生存状况的关系

图2 miR-125a-5p表达与卵巢癌患者术后3年生存状况的关系

表3 影响卵巢癌患者生存率的多因素分析

3 讨 论

卵巢癌是女性三大生殖器官恶性肿瘤之一，死亡率位于妇科肿瘤之首。全球每年约有12.5万人死于卵巢癌，早期卵巢癌无特异性临床表现，多数患者确诊时癌细胞已出现转移、侵袭[5]。卵巢癌患者预后较差，5年生存率不足50%。因此寻找影响卵巢癌患者的预后标志物对改善卵巢癌生存率有重大意义。

miRNA在细胞内具有重要的调节作用，通常可作用于一个或多个信使 RNA(mRNA)，通过降解mRNA 或抑制翻译水平对基因表达进行负调控。miRNA可作为肿瘤诊断、治疗及预后的标志物，是近年来的研究热点。

miR-497属于miR-15家族，该家族成员的5’端均存在AGCAGC的高度保守序列，作用多样，具有某种细胞种类特异性[6]。miR-497异常表达对肿瘤中相关基因起到调控作用，参与细胞多种生理活动，与肿瘤的发生发展、侵袭转移密切相关。研究表明，miR-497在多种肿瘤中呈低表达，如miR-497在宫颈癌中表达下调，且与高危型HPV感染关系密切[7]；miR-497在胃癌中呈低表达，且与肿瘤细胞的增殖负相关[8]。Wu等[9]研究发现，miR-497过表达能抑制乳腺癌细胞增殖，阻断细胞周期G1期的进程，诱导细胞凋亡，miR-497可通过影响细胞周期从而在肿瘤细胞增殖、凋亡过程中发挥作用。此外，miR-497还可靶向抑制内皮生长因子A(Vascular Endothelial Growth Factor A,VEGFA)的表达，通过调控相关信号通路参与卵巢癌血管生成[10]。余丹丹等[11]研究证实，miR-497在卵巢癌组织和卵巢癌SKOV3细胞株中表达下降，SKOV3细胞中miR-497的过表达可诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、迁移和侵袭。本研究显示，卵巢癌组织中miR-497表达与对照组相比明显降低，与前人研究相符；且随着卵巢癌分期的增加，miR-497表达显著下调，且其表达水平与临床分期、淋巴结是否转移有关，提示miR-497可能通过影响癌组织的血管生成及细胞周期参与调控卵巢癌细胞的侵袭、迁移等生物学过程。

MiR-125a-5p通过抑制、降解靶基因负调控基因进而影响细胞多种生理过程。数据库预测发现，VEGFA可能是miR-125a-5p的靶基因，VEGFA可参与调控细胞侵袭及血管重塑，推测miR-125a-5p可能通过影响VEGFA的表达，从而参与癌症患者的血管重塑、影响癌细胞侵袭[12]。另有文献报道，miR-125a-5p可靶向发育性下调基因9(NEDD9)，从而抑制肺腺癌的细胞增殖、诱导细胞凋亡[13]。研究表明，miR-125a-5p在胃癌临床组织样本和细胞系中的表达明显下降，与胃癌的发生和预后不良有密切联系[14]。以上研究提示，miR-125a-5p在多种癌细胞及组织中低表达，可能发挥抑癌作用。已有学者证实，卵巢癌SKOV3细胞株内miR-125a-5p的过表达，可诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖、迁移和侵袭[15]。Lee等[16]研究发现，miR-125a在卵巢癌组织和细胞系中下调，可降低癌细胞活力及迁移能力。本研究显示，miR-125a-5p在卵巢癌组织中呈低表达，与上述研究一致；随着卵巢癌分期的增加，miR-125a-5p水平显著下调，其表达与卵巢癌患者临床分期、淋巴结是否转移有关，提示miR-125a-5p可能通过影响卵巢癌患者的血管重塑及癌细胞侵袭，从而在卵巢癌的发生发展中发挥作用。

既往研究显示，miR-497、miR-125a-5p均可调控VEGFA表达，并参与调节PI3K/Akt信号通路，从而抑制癌细胞的侵袭、转移[10,15]。本研究显示，miR-497、miR-125a-5p低表达组患者3年生存率分别低于miR-497、miR-125a-5p高表达组，且miR-497、miR-125a-5p均为低表达的患者死亡率较高，提示可通过升高二者表达水平来延长患者生存时间，提高卵巢癌患者的生存率；COX回归分析显示，miR-497、miR-125a-5p低表达是影响卵巢癌患者生存率的独立危险因素，提示监测miR-497、miR-125a-5p表达水平，对卵巢癌患者的生存率具有一定的预测价值。

综上所述，在卵巢癌患者的癌组织中miR-497和miR-125a-5p表达下调，且miR-497低表达及miR-125a-5p低表达是影响卵巢癌患者生存率的独立危险因素。但本次研究纳入的样本量较少，且未将术后残余肿瘤对患者生存时间的影响考虑纳入COX模型中，日后会继续收集样本，扩大样本量，对miR-497和miR-125a-5p与卵巢癌的发生发展进行更加深入、全面的研究。