FTY720对肾缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用和机制#

李婷婷* 何冠军 刘亚西 赵蕾 康道林 涂发平△

(1. 川北医学院第二附属医院药剂科，四川 南充 637100；2. 川北医学院药学院，四川 南充 637100；3.高坪区人民医院肾内科，四川 南充 637100；4. 川北医学院附属医院麻醉科，四川 南充 637000）

肾缺血再灌注损伤（renal ischemiareperfusion injury，RIRI）是在肾移植、肾切除等复杂肾脏手中常见的病理生理过程，是引起急性肾损伤和肾功能衰竭的重要原因之一，此过程不仅导致肾脏本身缺血再灌注损伤，还会引起远隔器官如肝、肺、脑等器官损伤[1-3]，其机制主要与再灌注过程中中性粒细胞的迁移、细胞因子的表达、氧化应激的增强、巨噬细胞的集聚等有关[4-5]。

术后脑损伤是外科手术后常见的一种中枢神经系统并发症，主要表现为术后神经系统炎症及其导致的认知功能障碍等，明显影响患者术后恢复和生存质量[6]。芬戈莫德(Fingolimod，FTY720)是1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate, S1P）类似物，通过激活SIP受体发挥独特的免疫调节功能，是近年来备受关注的新型免疫调节剂[7-8]。FTY720作为S1P受体激动剂，与S1P受体结合能抑制巨噬细胞向肾移植、高血压肾病、过敏性结膜炎、实验性自身免疫性神经炎、脑缺血再灌注等动物模型的相应组织浸润，减轻炎性反应[9-12]。FTY720除了作用于免疫系统外，还能稳定地穿过血脑屏障，直接作用于中枢神经系统内S1P受体而发挥多重生物学效应[13]。基于此，本研究拟通过建立大鼠RIRI模型来探讨FTY720能否改善大鼠术后脑损伤及其机制，相关的研究国内外尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

清洁级雄性SD大鼠30只，体重 250~300g，由川北医学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(川)2018-18，环境温度21~25℃，自由进食、进水，采用随机数字表法分3组（n=10）：假手术组（Sham）、模型组（RIRI组）和FTY720干预组（FTY720组）。

1.2 试剂与仪器

FTY720购自美国cayman公司，临用时以生理盐水配成浓度为1mg/ml注射液；Tunel试剂盒购自瑞士罗氏公司；兔源Caspase-3一抗1: 1000购自美国Abcam公司，β-actin一抗1: 1000购自美国Cell Signaling Technology公司，羊抗兔IgG二抗购自北京中杉公司，Morris水迷宫购自北京吉安得尔科技有限公司。

1.3 RIRI模型的制备及药物注射方案

大鼠术前12h禁食，不禁水，以3%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，皮肤消毒，经背部双侧肋弓下缘距脊柱约0.5cm处行约长1.5cm的纵行切口，钝性分离并暴露双侧肾脏，分离双侧肾蒂，切除右肾。Sham组仅暴露左侧肾蒂，不阻断；FTY720组和RIRI组大鼠采用无创动脉夹阻断左侧肾蒂，可见肾脏由鲜红变紫黑色，表示夹闭成功，阻断45min后去除动脉夹恢复肾血流。三组均以0.25%布比卡因分层浸入切口镇痛，无菌丝线逐层缝合关腹，FTY720组于再灌注前15min通过腹腔注射FTY720（1 mg/kg），Sham组和RIRI组于再灌注前15min通过腹腔注射等体积生理盐水。再灌注后经腹腔补充林格氏液（3mL/100g，每小时1次），操作过程中维持动物体温在35.5℃~37℃。

1.4 标本采集

术后24h每组随机选取5只大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，断头取出脑组织和左侧肾脏，左侧脑组织和左侧肾脏分别置4%多聚甲醛中固定，右侧脑组织剥离海马组织后置于液氮罐保存。

1.5 HE染色观察大鼠肾脏和海马组织CA1区病理形态

大鼠肾脏组织和海马组织经浸洗、梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片( 4 μm) 、脱蜡、复水、染色等步骤后，于光镜下观察肾脏和海马组织CA1区的病理形态，评价其病理性损伤。

1.6 TUNEL法测定大鼠海马组织CA1区神经细胞凋亡情况

海马组织按1.5项方法石蜡包埋、切片( 4 μm) 、脱蜡、复水等步骤后，加入20 μg▪mL-1不含DNase的蛋白酶K试剂，于20~37℃下反应15~30 min，用pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗3次，加入TUNEL检测试剂50 μL，于37℃避光孵育1 h；用PBS清洗3次，以封闭液封片后置于显微镜下观察，记录视野中TUNEL染色阳性细胞的数量。

1.7 Western blot检测海马组织Caspase-3表达水平

从液氮中取出各组海马组织，称量、研磨、裂解、离心、提上清，BCA试剂盒进行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将不同分子量蛋白分离，并将目标蛋白转移至PVDF膜上。caspase-3、β-actin一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1h，清洗后滴加ECL化学发光试剂，曝光获取图像，使用ImageJ软件处理数据，结果以目的蛋白与内参蛋白条带灰度值比值表示。

1.8 Morris水迷宫检测大鼠认知功能

各组剩余大鼠于术后24h进行水迷宫实验，参照文献[14]。

实验指标: (1)定位航行实验，用于测试大鼠的学习能力：连续进行5 d，每天1次，分别从四个象限中点将大鼠面向池壁入水，记录每只大鼠从入水到爬上平台的时间，即为逃避潜伏期，若60 s后大鼠仍未找到平台，以60 s计算，并将其引导至平台停留10s。(2)空间探索实验，用于测试大鼠的空间记忆能力：第6 d进行空间探索实验，撤去平台，选取和平台对应的象限中点入水，记录60 s内大鼠穿越平台次数。

1.9 统计学方法

采用Spss17.0统计软件进行实验数据的分析，以均数±标准差（±SD）表示，两组间比较采用最小差异法（LSD)，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏组织的病理形态

光镜下Sham组大鼠肾组织未见明显病理改变，肾脏被膜完整，皮质和髓质分界清晰，其间可见少量炎细胞浸润；RIRI组和FTY720组大鼠肾组织出现明显病理改变，RIRI组肾脏皮质出现片状坏死，形成红色淡染的透明物质，皮质和髓质交界处肾小管和集合管灶状坏死，结构不清晰，肾小管和集合管中可见均质红染的蛋白样物质沉积；FTY720组肾脏出现局灶性坏死，肾小管上皮细胞脱落，呈均质淡红色物质，皮质和髓质交界处大量的肾小管和集合管萎缩、变性和坏死，结构不清晰，肾小管和集合管中可见粘液样物质沉积；以上结果说明大鼠肾缺血再灌注损伤模型造模成功，见图1。

2.2 海马组织CA1区病理形态

光镜下，Sham组海马神经元结构完整，排列整齐；RIRI组海马组织明显水肿，椎体细胞数量减少，细胞变性坏死，FTY720组海马病理变化较RIRI组明显改善，病理学评分差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2、图3。

图3 各组大鼠海马组织CA1病理评分比较（n=5）

2.3 TUNEL法测定海马组织CA1区神经细胞的凋亡情况

Sham组偶见凋亡细胞，RIRI组可见较多TUNEL染色阳性，细胞核呈棕褐色的凋亡细胞；与 Sham 组比较，RIRI组大鼠大脑海马组织CA1区凋亡细胞百分比明显增加（P＜0.05）。与RIRI组比较，FTY720组凋亡细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4、图5。

图4 各组大鼠海马组织CA1 TUNEL染色阳性细胞

图5 各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞数量比较（n=5）

2.4 Western blot 检测海马组织Caspase-3的表达水平

与 Sham组比较，RIRI组Caspase-3水平明显增加（P＜0.05）；与RIRI组比较，FTY720组Caspase-3水平显著降低（P＜0.05），如图6、图7所示。

图6 各组大鼠海马CA1区Caspase-3蛋白的电泳图

图7 各组大鼠海马CA1区Caspase-3蛋白表达水平比较（n=5）

2.5 大鼠的认知功能

与Sham组相比，RIRI组大鼠逃逸潜伏期明显延长，穿越平台次数明显减少，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与RIRI组相比，FTY720组大鼠逃逸潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增多，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠逃逸潜伏期、穿越平台指数比较（±SD，n=5）

表1 各组大鼠逃逸潜伏期、穿越平台指数比较（±SD，n=5）

注：aP＜0.05 vs Sham group；bP＜0.05 vs FTY720 group

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3 讨论

随着肾移植技术的不断提高，肾移植术后患者存活率不断提高，术后认知功能障碍正成为一个极其重要的临床问题。FTY720作为FDA批准的用来治疗复发-缓解型多发性硬化（MS）的口服免疫调节药物，能通过血脑屏障，可作为用于临床的具有神经保护作用的潜在药物，以减轻肾缺血再灌注对神经认知的影响。

本研究采用SD大鼠建立RIRI模型，结果显示RIRI组大鼠肾组织和海马组织CAI区出现了明显的病理损伤，同时RIRI组大鼠海马组织CA1区出现了大量的TUNEL染色阳性细胞，表明RIRI可导致大鼠海马组织CA1区神经细胞发生凋亡，表明肾缺血再灌注引起脑损伤模型造模成功。Morris水迷宫实验是目前公认的客观评价学习记忆功能的实验方法，主要用于研究海马损伤与空间学习记忆能力的关系[15]，本研究采用Morris水迷宫实验研究RIRI对认知功能的影响发现，与Sham组相比，RIRI组大鼠学习能力和空间记忆能力显著降低，与Barbosa PR等人[16]的研究结果一致，提示RIRI能够引起大鼠海马组织CA1区的神经细胞损伤，从而导致大鼠认知功能障碍。术后认知功能障碍的确切机制仍不明确，其中手术创伤引起的组织损伤激活机体先天性免疫系统，导致细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β[17-18]等大量释放是重要原因。细胞因子能够在相对薄弱的室周区，以主动转运方式穿过血脑屏障进入大脑，细胞因子也可刺激迷走神经传入纤维，进而激活中枢炎性反应通路，上述两种途径导致中枢神经系统内小胶质细胞激活，活化的小胶质细胞进一步合成和释放TNF-α、IL-6、IL-1β，细胞因子和小胶质细胞活化共同造成中枢神经系统炎症反应，最终导致认知功能障碍。但仍有研究表明[19-20]，FTY720能为病理环境中的神经元提供神经保护效应，主要是通过上调神经元细胞上Bcl-2/Bax蛋白的结合率，下调凋亡蛋白Caspase-3的表达水平，从而发挥抗细胞凋亡效应，有效改善认知功能障碍。本研究发现，FTY720组大鼠海马组织CA1区病理损伤、神经细胞凋亡数显著低于RIRI组，提示FTY720对RIRI大鼠脑组织损伤有保护作用，且水迷宫实验显示，FTY720组大鼠学习能力和空间记忆能力较RIRI组有显著改善，提示FTY720能够一定程度地改善RIRI引起的大鼠认知功能障碍。Western blot结果显示，与RIRI组相比，FTY720组大鼠海马组织CA1区Caspase-3的表达水平显著降低，提示FTY720可通过下调海马组织CA1区Caspase-3的表达从而发挥抗神经细胞凋亡的作用，与Di Menna L[20]等人研究结果相一致。

综上所述，RIRI造模大鼠可引起远隔器官脑组织的损伤和认知功能障碍，FTY720干预能显著改善大鼠RIRI引起的脑损伤和认知功能障碍，其机制可能与FTY720抑制Caspase-3的表达，从而减少海马组织CA1区神经元细胞凋亡有关。本研究为FTY720作为肾缺血再灌注引起脑损伤的潜在治疗药物提供了一定的基础。