促卵泡刺激素干预对小鼠卵巢玻璃化冻存过程中bFGF 蛋白表达的影响

张旭红，冯雪喆，郭欣欣，赵德鑫，李宇，杨文静，陈杰

(1. 乌兰察布市中心医院产科，内蒙古 乌兰察布 012000；2.内蒙古医科大学人体解剖学教研室，内蒙古 呼和浩特 010000；3.内蒙古医科大学口腔医学院，内蒙古 呼和浩特 010000)

0 引言

伴随肿瘤诊疗技术的飞速发展，病灶早期发现并施以精准治疗，使得肿瘤患者长期存活成为可能[1]，为此，抗癌治疗后患者的生活质量成为关注焦点。青年及未成年女性癌症患病率逐年上升[2]，如何避免医源性因素造成的卵巢早衰？如何在抗癌治疗过程中保护患者生育能力？是对生殖医学领域提出的严峻挑战。

卵巢组织玻璃化冻存技术是在患者接受抗癌治疗前冻存卵巢组织，待抗癌治疗结束后解冻卵巢组织并回植入患者体内，不仅没有耽误抗癌治疗，还可有效保存生育力，提高患者生存质量[3]。目前存在的问题是如何提高冻存效率，减少冻存过程中卵泡丢失、冰晶形成以及卵巢组织早衰等不利因素[4]。FSH 是重要的卵泡存活因子，可有效缩短冻融卵巢组织血流再灌注时间，提高冻存效率，在维护卵泡正常形态结构方面发挥积极作用[5]。bFGF 具有促进增殖平滑肌细胞以及内皮细胞游走的作用，是血管生成过程中重要的刺激因子，可促进新生血管形成，对受损的内皮细胞具有修复作用[6,7]。为此，我们拟通过观察小鼠卵巢玻璃化冻存过程中FSH 干预性保护措施对卵泡bFGF 蛋白表达的影响，证实FSH 干预的有效性，为临床体外冻存技术提供实验室依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物4 周龄C57BL/6J(证号:000664)雌性小鼠，光照周期为12h 照明/12h 黑暗，室温保持在22℃-24℃，自由取食饮水。

1.1.2 主要试剂促卵泡刺激素(FSH)

注射用重组人促卵泡刺激素(果纳芬)(生产厂家：瑞士默克雪兰诺制药厂，批准文号：S20080030)，人血清白蛋白(纯度≥96%)(Sigma)，一抗bFGF(Abcam)为兔抗小鼠多克隆抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 液体的配置基液

DMEM 与F12 等比例配置。培养液：含12%人血清白蛋白(HSA)。预平衡液：含1.5mol/L 乙二醇。玻璃化液：EG5.5-30 玻璃化液。解冻液：分别为含0.5mol/L、0.25mol/L 以及0.125mol/L 的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的获取采用动情间期小鼠，取完整卵巢组织并剥除被膜。

1.2.3 实验分组根据研究目的，将卵巢组织随机分组，每组6 枚，共分为3 组：①新鲜对照组(CG)：新鲜提取卵巢组织后，不施加任何干预直接固定、提蛋白。②玻璃化冻存对照组(VCG)：整个冻存过程无FSH 干预。③0.3IU/mL FSH 全程干预玻璃化冻存组(OG-FSH)：冻存全程添加FSH。

1.2.4 正常卵泡百分比计算[8]连续切片后进行HE 染色，每隔5 张选取一张切片，每组取6 张切片，在高倍镜下每张切片选取5 个高倍视野，根据卵泡形态的正常与否进行每高倍视野(high power field,HPF)的卵泡计数。

1.2.5 bFGF 免疫组织化学观察

①石蜡切片常规脱蜡至脱水。②抗原修复。③3% H2O2室温孵育。④山羊血清工作液封闭。⑤滴加一抗(1:100)。⑥恢复室温，PBS 冲洗。⑦滴加二抗。⑧DAB 显色。⑨复染。⑩封片。

1.2.6 bFGF 蛋白定量分析

①提取小鼠卵巢组织蛋白，检测蛋白含量。②备板。③上样。④跑胶。⑤转膜。⑥封闭。⑦5%脱脂奶粉稀释一抗(1:100)，4℃孵育过夜。⑧5%脱脂奶粉稀释二抗(1:10000)。⑨暗室中显色曝光。⑩Quantity One 软件分析实验结果。

1.3 统计学分析

采用SPSS 15.0 统计软件对所有数据进行分析。以(±s)表示计数资料、计量资料，采用单因素方差分析(One way ANOVA in Statistics)检验。计算F 值，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢组织形态学观察

HE 染色结果表明，VCG 组卵母细胞皱缩明显，正常卵泡百分比各组间比较差异有统计学意义(F=29.230，P=0.002)。其中VCG 组正常卵泡百分比显著低于CG 组和OG-FSH 组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1，表1。

图1 卵巢组织形态学观察(×400)

表1 卵巢组织形态学观察结果( ±s，卵巢数n=18 枚)

表1 卵巢组织形态学观察结果( ±s，卵巢数n=18 枚)

注：★与其他组比较差异有统计学意义，P＜0.05。

正常卵泡百分比/%CG(n=6 枚) 6.249±0.020 19.006±0.003 0.404±0.081 VCG(n=6 枚) 3.987±0.059 20.153±0.012 0.175±0.072★OG-FSH(n=6 枚) 8.356±0.019 18.877±0.028 0.533±0.072分组 正常卵泡数/(个/HP)卵泡总数/(个/HP)

2.2 卵巢组织bFGF 蛋白免疫组织化学法检测

免疫组织化学技术检测结果显示，bFGF 主要表达于细细胞核，组间比较差异有统计学意义(F=34.449，P=0.000)。其中OG-FSH 组bFGF 蛋白表达量显著高于CG 组和VCG 组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2，表2。

图2 卵巢组织bFGF 蛋白表达结果(×400)

表2 卵巢组织bFGF 蛋白表达IOD 值统计结果 ( ±s，卵巢数n=18 枚)

表2 卵巢组织bFGF 蛋白表达IOD 值统计结果 ( ±s，卵巢数n=18 枚)

注：★与其他组比较差异有统计学意义，P＜0.05。

分组 IOD 值CG(n=6 枚) 0.202±0.010 VCG(n=6 枚) 0.071±0.009 OG-FSH(n=6 枚) 0.533±0.018★

2.3 卵巢组织bFGF 蛋白表达的western-blot 检测结果

western-blot 检测结果表现为，组间比较差异有统计学意义(F=15.694，P=0.007)。其中VCG 组bFGF 蛋白表达量显著低于CG 组及OG-FSH 组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3，表3。

图3 卵巢组织bFGF 蛋白western-blot 检测结果

表3 卵巢组织bFGF 蛋白表达结果( ±s，卵巢数n=18 枚)

表3 卵巢组织bFGF 蛋白表达结果( ±s，卵巢数n=18 枚)

注：★与其他组比较差异有统计学意义，P＜0.05。

分组 灰度值CG(n=6 枚) 0.294±0.028 VCG(n=6 枚) 0.092±0.002★OG-FSH(n=6 枚) 0.403±0.018

3 讨论

目前的实验技术方法虽然实现了卵巢组织的快速冷冻，同时玻璃化液的渗透保护作用也大大提高了冻存效率，但卵巢组织玻璃化冻存技术在为女性癌症患者带来福音的同时仍然存在风险，卵泡的丢失和损伤在所难免[9]。卵巢储备功能是女性生育力的反映[10,11]，FSH 在抑制卵泡颗粒细胞凋亡的同时成为重要的卵泡天然保护因子[12]。王燕蓉团队前期研究成果显示[13]，小鼠卵巢玻璃化冻融过程中添加FSH 可提高卵泡存活率且缩短无血管吻合移植后的血管重建时间。bFGF是血管内皮细胞很强的促分裂剂和趋化因子[14]，其作为新生血管的主要调控因子[15]、特异性血管增殖因子，可通过酪氨酸酶受体(内皮细胞中)高效作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、血管形成。同时，bFGF 诱导生成的新血管通透性高，血浆蛋白易渗透至细胞外基质，利于成纤维细胞、内皮细胞的发生、发展[16]。

本实验HE 染色的冻融卵泡形态学观察显示，FSH 在小鼠卵巢玻璃化冻存全程的保护性干预可有效提高正常卵泡百分比，在保护卵泡形态结方面效果显著，抑制了冷冻过程冰晶形成对卵泡的结构损伤，抑制了颗粒细胞的凋亡。OG-FSH组正常卵泡百分比显著高于玻璃化冻存对照组，但是与新鲜对照组相比较，OG-FSH 组虽然正常卵泡百分比更高，但是差异无统计学意义(P＜0.05)。表明FSH 有效提高了冻融卵泡存活率，抑制了卵母细胞皱缩的发生，保护效果甚至达到卵泡未经历玻璃化冻存水平。

bFGF 蛋白表达实验结果显示，经免疫组织化学技术分析，bFGF 阳性细胞表达量IOD 值从高到低依次为：OG-FSH组、CG 组、VCG 组，差异有统计学意义(P＜0.05)。结果显示，FSH 在玻璃化冻存的干预有效促进了bFGF 蛋白的表达，在保护卵泡少受冻存损伤的同时可加速血管内皮细胞的成活与增值，为局部受损的卵巢内部结构构建了新的血管桥梁，从而保证多数卵泡的存活与正常生长发育。bFGF 蛋白的western-blot 免疫印记结果与形态学观察及免疫组织化学技术检测结果表达趋势一致，表现为冻存全程添加FSH 的干预保护措施更有利于bFGF 蛋白的表达，充分证实bFGF 不仅在促进新生血管发生方面效果显著，同时存在FSH 激素依赖性。FSH 可协同bFGF 的血管保护作用，提高血管增值率，加强内皮细胞的通透性，促进内皮细胞的发生发展。本课题组前期研究显示，FSH 在小鼠卵巢玻璃化冻存过程中可加速缝隙连结蛋白的表达，加强卵泡发育过程中细胞间信号转导，促进细胞间营养物质供给。而表达于细胞核的bFGF 是否通过细胞间通讯系统发挥对冻融卵泡的保护和促进作用？其是否受到细胞间缝隙连结蛋白的间接调控？需要我们进一步的研究和证实。

综上所述，FSH 在玻璃化冻存过程中的保护性干预可有效促进碱性成纤维细胞生长因子bFGF 的高表达，提高新生血管的发生率，间接阻止冻融过程中冰晶形成等不利因素的发生，提高冻存效率，降低冻融过程的卵泡丢失量，减少卵泡凋亡的发生，为临床操作提供可靠的实验室依据。