β-胡萝卜素对肉用母牛卵泡发育和繁殖轴相关基因表达的影响

李 宁，李梦雅，王之盛，彭瑞琪，余海源，薛 白，王立志，邹华围，胡 瑞，彭全辉

（四川农业大学动物营养研究，成都 611130）

β-胡萝卜素是维生素 A（Vitamin A，VA）的前体物质，其在生殖中的重要作用早在100多年前就被发现。全反式视黄酸（RA）是维生素A的主要活性形式，对雄性和雌性动物的繁殖功能均有重要影响。RA可通过与细胞核激素受体（RARα，RARβ和RARγ以及RXRα，RXRβ和RXRγ）结合进而对下游基因表达进行调控，也可以不通过核激素受体在细胞核以外的细胞质内通过激酶信号级联反应ERK1/2[1]、p38MAPK[2]以及 JNK[3]等对动物的生殖过程进行调控。

Kisspeptin是下丘脑弓状核中Kiss1基因编码的蛋白质[4]，其受体G蛋白偶联受体54（GPR54）在促性腺激素释放激素（GnRH）、黄体生成激素（LH）和卵泡生成素（FSH）释放的调节方面起关键作用[5]。诸多报道表明，β-胡萝卜素能改善动物繁殖性能[6-8]，但是β-胡萝卜素通过何种激酶信号途径调控肉牛母牛卵泡发育并不清楚。

因此，本文通过饲养和屠宰试验旨在揭示β-胡萝卜素促进肉牛母牛卵泡发育的分子机理，为促进肉牛卵泡发育、提高卵泡质量，提高肉牛母牛繁殖力提供营养调控手段。

1 材料和方法

1.1 试验材料

β-胡萝卜素购自成都艾凯生物科技有限公司，纯度为20%。

1.2 试验动物与试验设计

选取12头健康体重相近（285 kg±12.3 kg）15月龄母牛（西杂牛♂×犏牛♀），随机分为2组，每组6头。对照组饲喂基础饲粮，处理组在对照组的基础上每头每天额外添加β-胡萝卜素1 200 mg[9]。整个试验持续3个月。每天将β-胡萝卜素与1 kg TMR饲粮混合均匀后撒在料槽里供牛只自由采食，保证每天牛只将混有β-胡萝卜素的饲料全部采食。

1.3 试验饲粮

配方设计参照中国肉牛饲养标准（NY/T 815-2004）[10]，饲粮组成与营养水平见表1。

表1 饲粮组成与营养水平（风干基础）Table 1 Ingredients and nutrient levels of the diet（air-dry basis）

1.4 饲养管理

试验前所有牛只都驱虫健胃。正式试验前预试1周，让牛只熟悉饲养人员和操作流程。每天清扫牛粪。每2周牛舍消毒一次。试验期间，牛舍温度保持在10～25℃。

1.5 样品的采集

在正式试验结束的最后一天清晨8点饲喂前前腔静脉采集血液，每隔15 min采集一次，共采集8次。-4 ℃静置 30 min，1 500×g离心 10 min，收集血清，-20℃保存备测。

采血完成后将所有12头牛全部进行屠宰，采集下丘脑、垂体以及卵巢等组织样品，分装，-80℃冻存备测。

1.6 指标测定

1.6.1 卵泡的测定

通过超声评估（Mindray DP-2200，中国深圳）所有可见卵巢卵泡进行量化测定和分类。卵泡分类：小卵泡：2～5 mm；中卵泡：6～10 mm；大卵泡：大于 10 mm。具体操作步骤如下：将活牛保定好，待其平静后清除直肠粪便，初步定位子宫和卵巢。将套有避孕套的探头用手带入直肠，达到卵巢位置后，紧贴直肠壁扫描卵巢。按卵巢上卵泡超声暗区从小到大再到小确定为一个卵泡。在屏幕上出现典型的卵泡时冻结储存图像，并储存到电脑上后期做数据统计分析[11]。

1.6.2 激素LH和FSH的测定

采用竞争抑制酶联免疫试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司）检测血清中LH和FSH水平，均按照试剂盒说明书进行。

1.6.3 基因表达测定

用TRIZOL提取牛下丘脑、垂体以及卵巢组织中的mRNA，超微量紫外可见分光光度计（Nanohotometer TM Peal，Implen，德国）测mRNA浓度，将 mRNA 浓度调整至 500～1 200 pg/μL。通过 PrimeScritPTM RT Reaent Kit反转录试剂盒进行反转录，获得下丘脑、垂体以及卵巢细胞cDNA。参考NCBI数据库中已公布普通牛（Bos taurus）的 Kiss1、GPR54、GnRHR、EGR1、CaMKII、ERK1/2、JNK、p38、LHβ、FSHβ 和 ERα 以及GAPDH序列，通过Premier 5.0软件设计引物，具体引物信息见表2。应用荧光定量PCR仪（Light Cycler 480，Roche Applied Science，德国）进行 SYBR实时荧光定量检测。荧光定量采用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒。反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM II 7.5 μL，模板 1 μL，上、下游引物各 0.5 μL，ddH2O 5.5 μL；反应条件：95 ℃，预变性 5 min；95 ℃变性 10 s；退火45 s，72℃延伸35 s，循环35次。每个样本进行3次重复，用2-△△Ct法对结果进行统计分析。测定基因引物见表2。

表2 繁殖轴相关基因引物信息Table 2 Primers used for reproductive axis related genes RT-PCR

1.7 数据统计与分析

采用SAS 9.3对所有数据进行正态分布检验后进行 t检验，P＜0.05 表示差异显著，0.05≤P＜0.10 表示有显著差异的趋势。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素对肉牛母牛LH和FSH分泌的影响

LH分泌规律见图1，β-胡萝卜素组LH含量在15、60和 90 min时显著高于对照组（P＜0.001）。由图2可知，两个处理采集的8个时间点血清样品中FSH含量无显著差异（P＞0.05）

图1 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛LH分泌的影响Figure 1 Effects of β-carotene supplementation on LH secretion in beef heifer

图2 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛FSH分泌的影响Figure 2 Effects of β-carotene supplementation on FSH secretion in beef heifer

2.2 β-胡萝卜素对肉牛母牛卵泡发育的影响

饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛卵泡发育的影响见表3，β-胡萝卜素降低了小卵泡比例，提高了大、中卵泡比例（P＜0.001）。

表3 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛卵泡发育的影响Table 3 Effects of β-carotene supplementation on follicular development in beef heifer

2.3 β-胡萝卜素对肉牛母牛繁殖轴相关基因表达的影响

对肉牛的下丘脑-垂体性腺轴相关基因进行检测，结果见图3。添加β-胡萝卜素提高肉牛下丘脑中Kiss1（P＜0.001）、GPR54（P=0.032）、GnRHR（P＜0.001）、CAMKII（P＜0.001）、EGR1（P＜0.001）、ERK1/2（P＜0.001）基因表达量，对 JNK（P=0.711）和 p38MAPK（P=0.339）无显著影响。

图3 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛繁殖轴相关基因表达的影响Figure 3 Effects of β-carotene supplementation on reproductive axis related genes expression in beef heifer

2.4 β-胡萝卜素对肉牛母牛垂体LHβ和FSHβ基因表达的影响

对肉牛的垂体中LHβ和FSHβ基因进行检测，结果见图4。添加β-胡萝卜素提高肉牛下丘脑中LHβ 基因表达量（P＜0.001），对 FSHβ（P=0.322）无显著影响。

图4 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛垂体LHβ和FSHβ基因表达的影响Figure4 Effectsofβ-carotenesupplementationonpituitary LHβ and FSHβ submit genes expression in beef heifer

2.5 β-胡萝卜素对肉牛母牛卵巢ERα基因表达的影响

对肉牛的卵巢中ERα基因进行检测，结果见图5。添加β-胡萝卜素提高了肉牛卵巢中ERα基因表达量（P＜0.001）。

图5 饲粮添加β-胡萝卜素对肉牛母牛卵巢ERα基因表达的影响Figure 5 Effects of β-carotene supplementation on ERα gene expression in beef heifer

3 讨论

动物机体繁殖功能由下丘脑-垂体-性腺轴控制。下丘脑中的Kiss1基因表达145个氨基酸残基的kisspeptin，其活性形式与受体GPR54结合后调控GnRH神经元释放促性腺激素释放激素[12]，进而促进垂体分泌LH、FSH等生殖激素，生殖激素与卵巢上的受体结合后启动发情，促进卵泡发育，提高卵泡质量[13-14]。目前未见β-胡萝卜素调控Kiss1和GPR54基因表达的报道。本试验观察到添加β-胡萝卜素提高了GnRHR的表达。L.Flores等[15]研究表明，β-胡萝卜素可促进GnRH的表达和释放，这与本试验结果相一致。在垂体细胞中，GnRH通过蛋白激酶C和酪氨酸激酶在不同程度上能激活4个MAPK信号途径[3]。报道表明，在垂体αT3-1细胞中，GnRH处理能提高JNK的表达，但是JNK的激活是短暂的，处理60 min后JNK表达量达到峰值，此后开始下降；GnRH处理p38MAPK在60 min达到峰值，表达只提高了2～3倍，随后开始下降[16]。此外，ERK1/2也被激活，其表达提高了12倍。GnRH处理2 min后可以检测到ERK磷酸化，在7 min达到峰值，并在60 min内降至基础水平[17]。本研究表明，Kiss1/GPR54激活后提高了ERK1/2表达，但是对JNK和p38MAPK无显著影响。

有报道表明，在小鼠体垂体细胞中激活GPR54后可诱导细胞内贮存的钙离子的动员并激活ERK1/2[18]，小鼠垂体细胞（αT3-1）ERK2信号途径受GnRH调控[19]。但是GnRH诱导的活化机制在不同细胞之间存在差异。在人乳突状卵巢癌细胞（Caov-3）中，GnRHR通过结合鸟嘌呤核苷酸的G蛋白亚基（Gα）或解离的异源二聚体G蛋白（Gβγ）发出信号。在小鼠垂体瘤细胞（LβT2）细胞中，GnRH对JNK的激活不依赖于蛋白激酶C[20]。其二，GnRH脉冲模式也会影响ERK对GnRH的响应，小鼠αT3-1细胞持续暴露于GnRH时对ERK的激活是短暂的（2 h），而脉冲式GnRH则长时间激活ERK（8 h）[21]。另有报道表明，JNK在αT3-1细胞中可以被GnRH激活，但是激活ERK和JNK的钙离子来源不同，激活ERK的钙离子来源于细胞外，而激活JNK的钙离子来源于细胞内，并且ERK对GnRH的响应比JNK要快[16]。本试验观察到ERK被激活，表明β-胡萝卜素可能是打开了细胞钙离子通道，促进了钙离子向细胞内流入。

GnRH的激活可提高细胞内的游离钙离子浓度，钙离子可来源于细胞内钙离子储藏，也可能通过钙离子通道来自细胞外[22]。钙离子浓度的升高可提高钙调蛋白激酶II（CaMKII）表达，不管钙离子升高的脉冲频率是高还是低[23]。然而，快脉冲时促进LHβ表达，慢脉冲时促进FSHβ表达[24]。本试验检测到CaMKII表达升高，并且是LHβ表达升高。因此，β-胡萝卜素可能是高频率地提高了细胞内游离钙离子浓度。

早期生长反应因子1（EGR1）是GnRH在LβT2模型中由性腺激素引起的表达最高的基因[25]，能与LHβ启动子结合启动转录[26]。GnRH通过激活EGR1而启动LHβ表达。而诱导激活异源二聚体（FOS和JUN）激活蛋白1（AP1）转录因子则介导 FSHβ表达。因此，本试验观察到的LHβ表达升高与EGR1升高有关。

LH和FSH是糖蛋白异二聚体，都是由一个共同的α亚基（Cgα或αGSU）和一个独特的β亚基组成。α亚基基础表达水平足够高，受激素（GnRH）的影响较小[27]。FSH和LH合成与独特的β-亚基的表达密切相关，主要在β亚基的转录水平上受到调节[28]。脉冲性GnRH分泌可促进LHβ的转录[29]。但有报道表明，尽管山羊饲粮中添加β-胡萝卜素可以促进卵泡发育，但是该促进与LH分泌无关[30]。由于LH分泌是脉冲式的，该不一致的报道可能由血清样品的采集时间点不同所致。

雌激素受体ERα和ERβ介导不同的生理反应。ERα占主导地位，敲除Erα的小鼠呈现生殖障碍[31]。本项目研究对象为母牛，只测定了ERα。结果显示，β-胡萝卜素的添加提高了ERα的表达。以前的报道表明，添加全反式视黄酸可以提高大鼠子宫ERα的亲和力[32]，该结果与本研究一致。雌激素与受体结合进一步促进卵泡发育。

4 结论

饲粮额外添加β-胡萝卜素1 200 mg/头/天可以通过激活ERK1/2信号途径，促进LHβ转录和LH的分泌，进而促进卵泡发育，改善后备母牛繁殖性能。