丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟碳氮代谢及硝酸盐积累的影响

冯雨晴， 李耕， 赵园园， 周骏， 马雁军， 白若石， 刘德水， 史宏志

(1.河南农业大学烟草学院烟草行业烟草栽培重点实验室，河南 郑州 450002；2.上海烟草集团有限责任公司北京卷烟厂，北京 100024)

白肋烟是一种Yellow Burley (Yb)基因突变体，因其叶片本身色素含量较低，导致光合作用下降，从而不能为叶片氮还原同化过程提供充足能量，造成叶片中的硝酸盐大量积累[1-2]。烟草特有亚硝胺(Tobacco-specific nitrosamines, TSNAs)是一类存在于烟叶和烟草制品中的有害化合物，硝酸盐作为TSNAs的重要前体物，与后期烟草叶片TSNAs形成密切相关。研究发现，烟草叶片中硝酸盐含量与TSNAs积累呈显著性直线相关关系[3-4]。相同供氮条件下，白肋烟硝酸盐含量较普通烤烟高百倍，与其Yb基因突变导致的色素含量低、光合碳固定弱和氮素利用效率低密切相关[5-7]。因此，促进烟草叶片色素合成，提高烟草叶片光合作用和碳氮代谢能力，有助于降低叶片中硝酸盐和TSNAs形成和积累。

生长素是植物体内的重要细胞生长调节物质，参与调节植物细胞生长发育和生理生化过程，其中吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic acid, IAA)是生长素最主要的形式，且其生理功能主要表现在促进植物生长、调控植物细胞数目的增加和细胞伸长及有效缓解环境胁迫等方面[8-9]，同时还可与油菜素内酯、赤霉素、乙烯等生长激素信号通路相互作用，从而影响植物生长发育过程中各种代谢活动[10-12]。目前, 有关这类植物激素在烟草生产上的实际应用有不少研究。外源生长素不仅在促进作物根系伸长、地下及地上部分生物量的积累，提高叶绿素含量和净光合速率方面效果显著[13-15]，同时还可以调节烟株的碳氮代谢，增加其还原糖含量，降低烟草叶片中烟碱的含量，从而有效改善烟草叶片内在化学成分间的协调性[16-18]。研究表明，外源生长素可诱导植物NRT1.1(Nitrate transporters 1.1) 基因的表达，增强植物对硝酸盐的吸收，减少硝酸盐的积累[19-20]。丙三醇作为一种三碳碳源，一方面可以为细胞生长和代谢活动提供碳骨架，另一方面在光合作用、蔗糖代谢、细胞渗透调节及增强植物抗逆性中均能发挥重要作用[21-24]。近年来，丙三醇在降低植物叶片硝酸盐含量研究方面取得了一定的进展。相关研究发现，10 mL·L-1丙三醇在降低叶菜类蔬菜硝酸盐含量效果显著，与丙三醇促进植株叶片色素含量升高和光合作用有关[25-26]。此外，丙三醇可以促进烟草光反应途径、碳固定途径、蔗糖合成和氮代谢途径关键基因的表达，从而提高碳氮代谢和氮素利用效率，进而降低烟草叶片中硝酸盐含量[27]。已有研究证明，糖类物质可与细胞分裂素(Cytokinin, CTK)、生长素(IAA)等激素相互作用，在促进植物生长和个体发育的进程中有重要作用[28]。郎冬梅等[29]研究表明，外源葡萄糖与生长素混合施用对提高山定子碳氮代谢进程和氮素利用效率效果显著。白肋烟碳氮代谢能力弱，氮素利用效率低和硝酸盐积累含量高，丙三醇作为一种三碳碳源，与生长素混合施用能否更有效地改善白肋烟所存在的问题有待研究。因此，本试验选择苗期白肋烟TN 90为材料，选用清水为对照，设置丙三醇单独喷施、丙三醇和吲哚-3-乙酸混合喷施处理，研究不同喷施处理对烟苗生长指标、光合速率、色素含量、硝酸还原酶活性(Nitrate reductase, NRA)和谷氨酰胺合成酶活性(Glutamine synthetase, GSA)、碳氮化合物含量和氮素利用效率的影响，为减少烟叶硝酸盐和TSNAs积累量奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在河南农业大学国家烟草栽培生理生化研究基地光照培养架下培育烟苗。光照培养架条件如下:每12 h昼夜交替光照(时间段设置为7：00—19：00)，光照度设置为400 μmol·m-2·s-1。材料选择白肋烟品种TN 90，采用漂浮育苗，烟草种子用2 % 次氯酸钠溶液消毒，并将其播种在填满基质的200孔育苗盘中。浮盘规格:宽38 cm，长78 cm，高5.5 cm，每盘200孔。育苗框规格: 宽45 cm，长82 cm，高20 cm，育苗时在框中加入8 L清水，烟苗长至大十字期时开始加入8 L Hoagland营养液。培养烟苗长至4～5片真叶(苗龄约40 d)时，挑选大小均匀一致的壮苗，移栽至小花盆中(规格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm)，烟苗长至伸根期 (7片完全开展叶) 时开始进行喷施处理。每处理选取8株大小均匀一致的烟苗，共计24株。设置试验处理为:(1)CK，清水对照；(2)T1，1 mL·L-1丙三醇；(3)T2，1mL·L-1丙三醇+10 mg·kg-1吲哚-3-乙酸，连续喷施3 d，7 d后进行取样。丙三醇的体积分数参考史宏志等[27]文献，吲哚-3-乙酸的质量分数参考刘超等[30]和魏晓梅等[31]及自己的预试验的研究结果。

1.2 测定项目与方法

对各处理烟苗测定光合速率和生长指标后，将各处理烟苗分成2份，分别用于新鲜样本检测和杀青样本制作。各处理烟苗不同部位用去离子水冲洗干净，随后用滤纸擦干进行测定并保存样本。

1.2.1 烟草叶片净光合速率的测定 选取各处理大小均匀一致的烟苗，净光合速率由便携式光合测定仪(LI-6400，美国Licor公司)进行测定。光合仪器设置为开放通路 (手动进行)，红蓝光源外接光源光照度设为800 μmol·m-2·s-1，每棵烟所测叶片用外接光源照射15 min，使其光合速率达到稳定状态，测定时间选择9:00—12:00和14:00—17:00，测定部位选择烟苗最大功能叶(从下向上数，第3叶位)进行测定[32]。每个处理重复测定3次。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 丙三醇与吲哚-3-乙酸对白肋烟幼苗生长的影响

由图1可知，与对照相比，喷施处理TI后，株高、叶长和叶面积分别增加19.64%，10.41%和27.25%，茎粗略有下降，同时烟草根、茎、叶鲜质量分别增加16.34%，9.46%和28.94%，根、茎、叶干质量分别增加12.50%，10.13%和26.51%；而喷施T2处理后，株高、茎粗、叶长和叶面积分别增加40.35%，26.84%，20.29%和57.75%，根、茎、叶鲜质量分别增加32.68%，27.68%和45.51%，根、茎、叶干质量分别增加43.75%，27.85%和41.13%。说明外源丙三醇和生长素能在不同程度上促进白肋烟植株生长，其中T2处理更有利于促进烟株生长。

2.2 丙三醇与吲哚-3-乙酸对白肋烟叶色素质量分数和净光合速率的影响

由图2可知，T1和T2处理均能提高烟草叶片色素质量分数和净光合速率，且T2处理的效果更为显著。与CK相比，喷施T1后叶片中叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素质量分数和光合速率分别增加22.86%，18.75%，9.09% 和28.89%；相比于T1处理，T2处理叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素质量分数和光合速率分别增加17.44%，2.63%，50.00% 和25.34%。

2.3 外源丙三醇与吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片总糖和还原糖质量分数的影响

由图3可知，T1和T2处理后白肋烟叶片中总糖和还原糖质量分数均显著高于CK，两者之间无显著差异。与CK相比，T1处理后白肋烟叶片中总糖和还原糖质量分数分别增加16.38%和31.25%，T2处理后白肋烟叶片中总糖和还原糖质量分数分别增加18.10% 和37.5%。

2.4 丙三醇与吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片氮代谢关键酶活性的影响

由图4可知，TI 和 T2 处理均显著提高了白肋烟叶片中NRA，且 T2 处理效果更为显著，而对GSA略有提高。与 CK 相比，喷施 T1 和 T2 后白肋烟叶片中NRA分别提高20.35%和36.73%，GSA分别提高7.29% 和9.99%。说明T2处理更有利于促进苗期白肋烟NRA 和GSA活性的提高，从而降低白肋烟叶片中硝酸盐积累量。

注：不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different lower-case letters mean significant difference at 0.05 level among different treatments of the same variety. The same as below.图1 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟幼苗生长的影响Fig.1 Effects of glycerol and indole-3-acetic acid on the growth of tobacco seedlings

2.5 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片氮化合物质量分数的影响

2.6 丙三醇与吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片氮素利用效率和氮素积累量的影响

由图6可知，喷施T1和T2均能提高白肋烟叶片氮素积累量和氮素利用效率。与对照相比，喷施T1和T2后，白肋烟叶片氮素积累量分别提高14.21%和25.93%，氮素利用效率分别提高10.89%和12.18%。说明与T1 处理相比，T2 处理更有利于促进白肋烟叶片中干物质积累，从而提高白肋烟叶片氮素积累量和氮素利用效率。

图2 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片净光合速率和色素质量分数的影响

图3 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片还原糖和总糖质量分数的影响

注：ns表示不同处理间差异不显著。下同。Note: ns means no difference among different treatments of the same variety. The same as below.图4 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟草叶片NRA和GSA活性的影响Fig.4 Effects of glycerol and indole-3-acetic acid on NRA and GSA in tobacco leaves

图5 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片氮化合物质量分数的影响

图6 丙三醇和吲哚-3-乙酸对白肋烟叶片氮素积累量和氮素利用效率的影响

3 结论与讨论

丙三醇单独喷施处理和丙三醇与吲哚-3-乙酸混合喷施处理后，白肋烟烟苗大小、生物量、色素质量分数、光合速率、总糖还原糖质量分数、硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质量分数和氮素积累量均增加，叶片氮素利用效率明显提高，并且总氮和硝酸盐质量分数显著降低，其中丙三醇与吲哚-3-乙酸混合处理在促进白肋烟苗碳氮代谢和降低硝酸盐质量分数方面效果更佳。丙三醇和吲哚-3-乙酸混合喷施更有助于提高白肋烟叶片碳氮代谢能力，对降低白肋烟叶片硝酸盐质量分数效果较好。