LC-MS/MS法同时检测人血浆中氟尿嘧啶、尿嘧啶和二氢尿嘧啶的浓度及其临床应用

范先煜，汪硕闻，范国荣

(上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海 200080)

氟尿嘧啶(5-FU)是一种广谱、细胞毒性抗肿瘤药，常单独或与其他化疗药物联合使用，是治疗头颈部癌、胰腺癌、胃癌及结直肠癌的重要药物。5-FU的治疗窗窄，体内浓度个体间差异大，因此5-FU的临床疗效和药品不良反应(ADRs)在不同患者间也具有很大差异。研究发现，基于体表面积给药的多数患者都没有达到最佳的药物暴露。许多研究已指出，根据5-FU的药动学性质调整剂量可通过降低毒性和提高疗效显著改善临床结局[1-2]。

体内约80%的5-FU通过二氢嘧啶脱氢酶(DPD)快速代谢成无活性的代谢产物，DPD的活性存在个体差异，活性下降可导致5-FU的清除受阻[2]。由于DPD也是体内尿嘧啶(U)代谢为二氢尿嘧啶(UH2)的关键酶，酶活性缺失会导致转化的减少，因此可通过化疗前测定血浆中UH2与U血药浓度比值(UH2/U)，间接反映DPD活性大小，用于预测患者给药后可能发生的毒性反应[3]。相比用药物遗传学方法筛查基因多态性，测定UH2/U具有更高的灵敏度[4]，且节省检测时间和成本[5]，能够可靠地反映酶活性的缺失。

为了尽可能降低毒副反应的发生，临床上可通过UH2/U预测5-FU首轮治疗的剂量，再根据5-FU的血药浓度调整后续剂量。因此，建立一种同时检测血浆中5-FU、U和UH2浓度的分析方法，对5-FU用药方案的优化有重要意义。国内的报道多采用HPLC法测定5-FU[6]或UH2和U[7]，但由于这类化合物极性大，血浆中其他内源性物质易对分析造成干扰，且有定量下限较高、分析时间较长等缺点。目前国内尚无基于LC-MS/MS法同时测定人血浆中5-FU、U和UH2浓度的报道。本研究建立了LC-MS/MS法同时测定人血浆中这3种物质，并应用于消化道肿瘤患者的治疗药物监测，现报道如下。

1 材 料

1.1 仪器 LC-20A液相色谱仪、8040三重四级杆串联质谱仪(日本岛津公司)；MS-X可调式涡旋振荡仪(美国赛洛捷克公司)；Sorvall Legend Micro 21R微量离心机[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；CPA225D十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；VapAuto S60 多样品自动浓缩仪(美国ATR公司)。

1.2 试药 5-FU对照品(纯度>99%，批号M0701AS)、U对照品(纯度>99%，批号J0803AS)、UH2对照品(纯度>97%，批号D0104A)、溴尿嘧啶(BU)对照品(纯度>98%，批号F0129AO)均购于大连美仑生物技术有限公司；甲醇(色谱纯)、异丙醇(分析纯，德国Merck公司)；甲酸、乙酸乙酯(分析纯，上海安谱实验科技有限公司)；二氯甲烷(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)。实验所用去离子水由Research UV超纯水机(上海和泰仪器有限公司)制得。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Waters Atlantis T3色谱柱(100 mm×3.0 mm,3 μm)，流动相为：0.1%甲酸水溶液(V/V，A相)-甲醇(B相)，洗脱梯度(0～2.0 min，5%B；2.0～2.1 min，5%～40%B；2.1～5.0 min，40%B；5.0～5.1 min，40%～5%B；5.1～7.0 min，5%B)，流速0.35 ml/min，柱温35 ℃，进样量10 μl。

2.2 质谱条件 使用电喷雾离子源，以多反应监测模式(MRM)进行分析，并以正离子模式检测UH2和U，用负离子模式检测5-FU和内标BU。表1和图1分别为化合物的离子对和质谱特征性参数及二级质谱图。

表1 各待测物及内标的离子对和质谱特征性参数Table 1 The characteristic parameters of ion pair and mass spectrum of each analyte and internal standard

图1 氟尿嘧啶、二氢尿嘧啶、尿嘧啶和内标溴尿嘧啶的二级质谱图Figure 1 Secondary mass spectrum chromatograms of fluorouracil,dihydrouracil,uracil and internal standard bromouracilA:氟尿嘧啶;B:二氢尿嘧啶;C:尿嘧啶;D:溴尿嘧啶

2.3 溶液配制 分别精密称取5-FU、UH2、U、BU对照品10.00 mg，置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容，得到浓度为1.0 mg/ml的对照品储备液。其中，5-FU、UH2和U的对照品称取两份，分别配制标准曲线和用于质控的对照品储备液与工作溶液。对照品储备液用50%甲醇逐级稀释得系列工作溶液：5-FU和UH2的标准曲线工作液浓度分别为100、200、500、1000、2500、5000、10 000 ng/ml，U的标准曲线工作液浓度分别为50、100、250、500、1250、2500、5000 ng/ml。5-FU和UH2定量下限，低、中、高浓度的质控工作液浓度分别为100、250、2000和8000 ng/ml，U为50、125、1000和4000 ng/ml。内标BU工作液的浓度为3.3 μg/ml。对照品储备液和工作溶液均置于-20 ℃保存待用。

2.4 血样前处理 采用液-液萃取的方法对血浆样品进行前处理。于200 μl血浆样品中加入10 μl BU内标溶液(3.3 μg/ml)，涡旋30 s后，再加入1 ml乙酸乙酯-异丙醇(85∶15，V/V)作为萃取剂，充分涡旋5 min，以1.62×104×g离心10 min(4 ℃)后，取900 μl上层有机溶液转移入新离心管中，并于35 ℃的温和氮气流下吹干浓缩。获得的干燥残渣用50 μl 5%(V/V)的甲醇-水溶液和10 μl二氯甲烷复溶，以1.62×104×g离心10 min(4 ℃)，将40 μl上清液转移入进样小瓶中用于分析。

2.5 样品采集 分别于化疗前和5-FU静脉滴注后22 h采集患者全血5 ml，收集于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的采血管中，立即分离血浆。对患者的血药浓度监测经上海交通大学附属第一人民医院伦理委员会审批通过。

2.6 方法学验证 根据2015版《中华人民共和国药典》四部“生物样品定量分析方法验证指导原则”[8]，对本研究建立的分析方法进行方法学验证。

2.6.1 方法专属性 选取6批不同来源的空白血浆与定量下限样品比较以评价方法的专属性，典型图谱见图2，5-FU及内标BU均无内源性干扰。对内源性物质U和UH2专属性的评估通过配制75 mg/ml牛血清白蛋白溶液作为替代基质以反映定量下限(LLOQ)样品实际的响应[9]。5-FU、UH2、U和BU在血浆中的保留时间分别为2.70、2.27、2.40和4.90 min，均分离良好。

2.6.2 标准曲线和定量下限 取2.3项下标准曲线工作液与内标溶液，加入空白血浆中，进样分析。使用峰面积比(分析物/内标，y)相对于浓度(x)作最小二乘法回归分析得到线性方程，并以1/x2作为权重因子，得到5-FU的标准曲线方程为y1=0.003 430x1-0.001 090(r=0.999)；UH2的标准曲线方程为y2=0.009 761x2+0.000 200 1(r=0.997)；U的标准曲线方程为y3=0.033 83x3-0.013 77(r=0.999)，表明5-FU和UH2在10～1000 ng/ml，U在5～500 ng/ml浓度范围内线性良好。在计算UH2和U的标准曲线方程时，以空白血浆中UH2或U与内标BU的峰面积比作为本底值，将标准曲线各点的UH2或U与内标的峰面积比减去本底值，从而得到浓度与实际峰面积的对应关系[9]。

图2 氟尿嘧啶、二氢尿嘧啶、尿嘧啶及内标溴尿嘧啶的LC-MS/MS谱图Figure 2 LC-MS/MS chromatograms of fluorouracil,dihydrouracil,uracil and internal standard bromouracilA：健康志愿者空白血浆；B：肿瘤患者空白血浆；C：定量下限样品；D：肿瘤患者实测血样

2.6.3 准确度和精密度 通过将3批质控样品与随行标准曲线进行比较，考察日内和日间精密度和准确度，其中准确度用回代标准曲线后计算得到的理论浓度与实际浓度间的相对误差(RE)表示，精密度用RSD表示。结果见表2，RE均在88.32%～111.93%，RSD均<8.00%(n=5)，表明本方法准确度和精密度均符合要求。

表2 LC-MS/MS法测定人血浆中氟尿嘧啶、尿嘧啶和二氢尿嘧啶的精密度和准确度Table 2 Accuracy and precision of fluorouracil,uracil and dihydrouracil in human plasma (n=5)

2.6.4 稳定性 考察血浆样品室温放置2 h、冻融循环3次(-40 ℃)、于-80 ℃放置30 d和于自动进样盘放置24 h(室温)的稳定性。将放置后的低、中、高3个浓度(UH2、5-FU浓度分别为25、200、800 ng/ml，U浓度分别为12.5、100、400 ng/ml)的质控样品进样分析，并与新鲜配制的标准曲线工作液算得的线性方程进行比较，结果在上述条件下RE均<108.7%(n=5)，表明人血浆中的5-FU、UH2和U稳定性良好。

2.6.5 提取回收率和基质效应 将按2.4项下方法提取的低、中、高三个浓度的样品与对应浓度的纯溶液比较，计算提取回收率，结果UH2和U的回收率相对较低，分别为48.10%和60.06%，但在较低的回收率下仍可达到定量下限，并且不降低分析方法的可靠性。BU的回收率>120%，原因可能是基质增强的影响。

在经液-液萃取的空白基质(不同来源的6批样品)中标准添加纯溶液，使浓度与低、高浓度质控样品相同，并与相应浓度纯溶液比较，计算基质效应(MF)。结果5-FU、UH2和U的MF均在100.03%～106.87%，且RSD均≤8.58%(n=3)，提示血浆对各化合物没有明显的基质效应，且不同批次的基质间无明显区别。BU的MF为118.88%，显示微弱的基质增强，可以解释提取回收率的同步偏大。

2.7 临床应用 收集本院使用5-FU治疗的结直肠癌和胃癌患者共9例，其中男性7例，女性2例，平均年龄65岁。9例患者5-FU的稳态血药浓度为(402.53±176.33)ng/ml，中位血药浓度为416.50 ng/ml (174.66～634.95 ng/ml)。化疗前患者血浆中U的浓度为(35.03±25.55) ng/ml， UH2的浓度为(211.42±119.64) ng/ml， UH2/U为7.33±3.43。5-FU开始滴注后22 h，U的浓度为(67.41±29.44) ng/ml，UH2的浓度为(300.42±119.64) ng/ml，UH2/U为5.10±2.20。患者的基本信息、用药剂量及5-FU血药浓度等见表3和图3。由图3可见，5-FU给药后，U和UH2的血药浓度均较给药前上升，其中U的变化具有显著性差异(P=0.02)；UH2/U较给药前显著下降(P=0.02)，提示U转化为UH2的过程受5-FU的影响。

3 讨 论

3.1 LC-MS/MS法的优化

由于5-FU、UH2、U具有相似的化学结构且极性较大，因此获得良好的分离度、峰型及色谱柱上的保留是优化分析方法时的难点。选择可承受高水相条件的色谱柱用于分离，预实验中比较了Agilent ZORBAX AQ色谱柱和Waters Atlantis T3色谱柱，结果表明后者具有更好的保留性能和峰型。以往文献常见用负离子模式检测UH2和U[10]，在预实验过程中则发现，当采用正离子模式电离时，UH2和U的响应相比负离子模式明显增加；而5-FU和BU则使用负离子模式电离，正负离子通道间快速切换的效率可以保证峰形和响应均不受影响。由于BU为人体内不含有的外源类似物，不会在实测过程中造成干扰，因此选用BU作为内标。

表3 9名患者的基本信息、用药剂量、氟尿嘧啶血药浓度及二氢尿嘧啶与尿嘧啶血浆浓度比值Table 3 Basic information,dosage,concentration of fluorouracil and the ratio of plasma concentration of dihydrouracil to uracil in the 9 patients

图3 氟尿嘧啶给药前后尿嘧啶、二氢尿嘧啶的血浆浓度及二氢尿嘧啶与尿嘧啶血浆浓度比值的变化Figure 3 Changes in plasma concentrations of uracil and dihydrouracil in plasma and the ratio of plasma concentration of dihydrouracil to uracilbefore and after administration of fluorauracil○：尿嘧啶；●：二氢尿嘧啶；△：二氢尿嘧啶与尿嘧啶血浆浓度比值；*P<0.05，给药前后比较

3.2 血样前处理方法的优化 在血样前处理方法的优化中，分别考察了蛋白沉淀、液-液萃取和固相萃取。据文献中的前处理步骤[11]，血浆样品经甲醇沉淀蛋白，上清吹干后再复溶，但是由于上清中含有一定比例的水，吹干效率较差。由于5-FU相对分子质量小、极性大，在固相载体上难以保留且容易直接被水相洗脱而损失，导致提取回收率低，因此不适合用固相萃取的方法进行前处理。参考文献报道[10]，使用乙酸乙酯-异丙醇(85∶15，V/V)作为液-液萃取剂，可同时提取血浆中的5-FU、UH2和U，操作过程简便，效率较高，且提取回收率满足临床检测的要求。

3.3 临床应用 有研究表明，5-FU长时间输注时，可以用稳态血药浓度代替血药浓度曲线下面积(AUC)预测ADRs的发生[12]。5-FU静脉持续滴注给药时，2 h左右可达稳态血药浓度，在22 h后血药浓度差异较小[2]。因此，本研究取5-FU持续静脉滴注22 h的血样检测5-FU稳态血药浓度。结果表明，患者间5-FU血药浓度的差异较大，其原因可能包括药物代谢酶的基因差异、身体状况、食物和药物之间的相互作用等[2]。研究显示，直接检测细胞中DPD的活性，其结果与5-FU的血浆水平相关性较弱，且较费时费力[5]，因此，化疗前测定UH2/U，可作为间接指标帮助判断DPD活性缺陷，从而预测毒性[13]，且UH2/U=4为发生毒性反应的临界值[3]。在本研究测得的结果中，9例患者间UH2/U差异较大，有2例患者的UH2/U<4，其中1例发生3度腹泻，可能与5-FU代谢迟缓有关。患者使用5-FU后，UH2/U平均下降约30%，可能是因为5-FU在体内通过DPD代谢为无活性产物，从而产生竞争作用。因此DPD活性较差的患者须注意5-FU在体内消除受阻，易引起蓄积而发生ADRs。也有研究表明，测定5-FU给药期间的UH2/U可以得到更好的预测结果[14]。本研究发现，一些具有较高UH2/U的患者也有较高的5-FU血药浓度，提示仅考察DPD活性对于预测5-FU的暴露和代谢情况并不够，因此需要结合5-FU的血药浓度检测结果指导个体化用药。由于本研究纳入的病例数较少，血药浓度测定结果波动较大，在下一阶段应扩大样本量继续研究分析。