糖碳源和氨基酸氮源对苍白杆菌属发酵产生物表面活性剂的影响

陈西朋，司伟民，孙玉梅*，李宪臻

（大连工业大学生物工程学院，辽宁 大连 116034）

生物表面活性剂具有促进非水溶性液体与水混合乳化和降低液体表面张力的能力，又把有乳化能力的称为生物乳化剂，把降低表面张力的称为生物表面活性剂。目前微生物发酵法生产生物表面活性剂的瓶颈是产量低和成本高，解决途径有分离高产微生物、优化培养基成分和利用低成本原料等[1]。

产生物表面活性剂的微生物包括细菌、真菌和酵母。其中对假单胞菌（Pseudomonasspp.）、不动杆菌（Acinetobacterspp.）、芽孢杆菌（Bacillussp.）、假丝酵母（Candida lipolytica）、链霉菌（Streptomycesspp.）、红球菌（Rhodococcusspp.）、无色杆菌（Achromobacterspp.）、短杆菌（Brevibacteriumspp.）、节杆菌（Arthobacterspp.）等微生物生产生物表面活性剂研究较多[2-10]，但对苍白杆菌（Ochrobactrum）产生物表面活性剂的研究相对较少。1990年最早分离出的人苍白杆菌（O.anthropi）利用0.3%酵母浸粉和1%葡萄糖产出对热稳定的生物乳化剂，产物含蛋白组分，对各种烃水混合物有强乳化活性[1]。有的菌株产降低表面张力的脂肽[7]。菌株O.intermediumCN3所产糖脂生物表面活性剂耐热、高盐度和pH值，对己烷和废机油的乳化活性高达65%以上，可有效促进石油污泥中烃降解[11]。嗜盐菌株Ochrobactrumsp.BS-206利用丙酮酸钠和硝酸钠发酵生成的生物表面活性剂Ochrosin不仅能降低表面张力和乳化多种烷烃，还具有抗菌、抗粘、拒食和杀虫活性[12]。菌株O.intermedium将废弃烃转化为具有高乳化活性的聚羟基丁酸酯（poly hydroxybutyrate，PHB）[13]。菌株O.intermedium的游离细胞和海藻酸钙固定化细胞利用2%十六烷（V/V）和1 g/L NH4NO3，发酵48 h能降低表面张力至33 mN/m，发酵72 h乳化活性达到68%～93%[14]。菌株O.intermediumMZV101能同时生产适于洗涤的耐高温（70～90 ℃）和碱性（pH9～13）的脂肪酶和生物表面活性剂，产物对重金属离子、去污剂和有机溶剂稳定，且抑制多种微生物[15]。水牛瘤胃源菌株O.pseudintermediumC1可以利用废机油生产胞外多糖生物乳化剂[16]。菌株O.anthropiAD2以酵母浸粉和蛋白糖肽为氮源，利用葡萄糖补加辛烷、轻油、重油和原油能产胞外多糖乳化剂，乳化活性范围宽，且化学组成和乳化活性依培养条件而异，但无表面活性剂活性[17]。菌株O.anthropiRIPI5-1[18]以原油为碳源生产生物表面活性剂。菌株O.anthropi2/3以棕榈油废渣和味精废水为碳源和氮源时，最适碳氮比（C/N）为25，而C/N在30～50会抑制糖脂表面活性剂产生[19]。

本实验室在之前的研究中筛选到生物乳化剂生产菌株，发现蔗糖比葡萄糖、硝酸钠比硫酸铵均更能促进该菌产生物乳化剂[20-21]。本研究通过对细胞生长、发酵液表面张力和乳化活性的分析，进一步探讨糖碳源、氨基酸氮源以及碳氮比对其生产生物表面活性剂发酵的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验菌株

苍白杆菌（Ochrobactrumsp.）XY-1：本实验室自行分离、筛选、鉴定、保藏。

1.1.2 培养基

种子培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠5 g/L。115 ℃灭菌30 min。

斜面种子培养基：在种子培养基中加入20 g/L琼脂。115 ℃灭菌30 min。

发酵基础培养基：KH2PO43.4 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，酵母浸粉0.2 g/L。培养基均调pH至7.0，于115 ℃灭菌30 min。

1.1.3 化学试剂

木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油：天津市科密欧化学试剂有限公司；谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸：国药集团化学试剂有限公司；实验所用试剂均为分析纯试剂或生化试剂。

1.2 仪器与设备

PHS-3C型精密pH计、722S型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；JZY-180界面张力仪：河北省承德市材料试验机厂；Avanti J-E离心机：美国贝克曼库尔特有限公司；SHP-150生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液制备

取斜面保存的Ochrobactrumsp. 菌种一环接种于斜面种子培养基上，在30 ℃活化培养48 h后，将2环活化菌体接种于100 mL种子培养基中，30 ℃、160 r/min摇床培养48 h，得种子液。

1.3.2 发酵

以8%（V/V）接种量将种子液接于发酵培养基中，30℃、160r/min摇床培养7d，按时取样测量。发酵液在4℃、13300×g离心20 min获得上清液，用于相关测定。

1.3.3 糖碳源、氨基酸氮源及碳氮比对菌株产生物表面活性剂发酵的影响

在发酵基础培养基中，添加4 g/L硝酸钠为氮源，分别以10 g/L的木糖、果糖、蔗糖、乳糖和甘油为碳源，研究糖碳源对菌株发酵产生物表面活性剂的影响。以10 g/L蔗糖为碳源，分别以7.35 g/L谷氨酸、6.65 g/L天冬氨酸、3.65 g/L赖氨酸、2.18 g/L精氨酸、5.85 g/L缬氨酸为氮源，研究氨基酸氮源对菌株发酵产生物表面活性剂的影响。以4 g/L硝酸钠为氮源，分别以质量浓度1.57 g/L、15.66 g/L、31.32 g/L、46.98 g/L和62.64 g/L的蔗糖为碳源，使碳氮比（C/N）分别为1、10、20、30和40，研究碳氮比对菌株发酵产生物表面活性剂的影响。

1.3.4 测定方法

菌体密度：采用比浊法测定[22]，以发酵上清液为空白，以波长600 nm测定的发酵液光密度值OD600nm表示。

发酵液pH：使用pH计于室温条件下（25 ℃）测定。

发酵液表面张力：采用吊环法于室温条件下（25 ℃）测定[23]。

发酵液乳化活性：取1.5 mL发酵上清液，与0.9 g液体石蜡于10 mL具塞刻度管中手动摇匀150次，静置24 h，乳化层高度占液体总高度百分比即为发酵液乳化活性。

发酵液总糖含量：采用苯酚-硫酸法测定[24]。

发酵液还原糖含量：采用3,5-二硝基水杨酸法测定[25]。

1.3.5 数据处理

所有发酵和测定分别重复3次，结果为平均值±标准差。由软件Microsoft Excel 2019进行方差分析和独立样本T检验。当P值≤0.05时，有显著性差异；P值＞0.05时，无显著差异。采用Origin 9.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同糖碳源对菌株发酵产生物表面活性剂的影响

由图1A可知，以不同糖碳源发酵时，发酵过程中发酵液的总糖或甘油浓度均呈下降的趋势，下降速度依甘油、蔗糖、乳糖、果糖、木糖的顺序减小，而总糖残留量依蔗糖、乳糖、木糖、果糖、甘油的顺序减小。由图1B可知，细胞生长速度依甘油、蔗糖、乳糖、果糖、木糖的顺序减小，最大细胞生长量依蔗糖、甘油、木糖、果糖、乳糖的顺序减小，而最大生长耗时依蔗糖、甘油、木糖、果糖、乳糖的顺序增大。菌体生长速度与碳源消耗速度相一致，但碳源消耗量与菌体最大生长量却不一致。由图1C可知，在发酵过程中，不同糖碳源的发酵液乳化活性升高程度依蔗糖、乳糖、木糖、果糖、甘油的顺序减少（依次为56.3%、50%、48%、48%、40%），蔗糖为碳源发酵的乳化活性（56.3%）显著高于其他碳源（P＜0.05）；乳化活性升至最高所需发酵时间依蔗糖、乳糖、木糖、甘油、果糖的顺序延长。由图1D可知，不同糖碳源发酵液的表面张力下降后均有回升，表面张力下降程度依木糖、乳糖、甘油、蔗糖、果糖的顺序减少（依次为51.13 mN/m、54.20 mN/m、55.18 mN/m、57.93 mN/m、58.18 mN/m），差异显著，表面张力下降至最低所需发酵时间依蔗糖、乳糖、甘油、木糖、果糖的顺序延长。

图1 不同糖碳源发酵产生物表面活性剂时总糖或甘油（A）、细胞生长量（B）、乳化活性（C）、表面张力（D）变化Fig. 1 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D) when biosurfactant was produced by fermentation with different saccharides carbon sources

结果表明，实验菌株可以利用上述碳源生长和代谢，不同碳源发酵液表面张力下降幅度均较小（小于20 mN/m），所以，实验菌株发酵所产表面活性剂降低液体表面张力的活性较低或生成量较少，但能生成较大量或者活性较高的生物乳化剂。蔗糖碳源被直接用于菌体生长和代谢，有利于菌体较快较大量生长且高产生物乳化剂；虽然乳糖碳源的同化作用最差，但有利于合成生物乳化剂和生物表面活性剂。甘油主要被较高效地用于菌体生长和生物表面活性剂合成。利用木糖和果糖生长和生产的水平都较低。木糖和果糖碳源发酵3 d后发酵液乳化活性才升高，可能与期间菌体生长较少有关。甘油碳源发酵的前2天菌体生长较快，但发酵液乳化活性却低于蔗糖和乳糖碳源的发酵液。说明菌体生长过快和太少均不利于实验菌株发酵生产生物表面活性剂。综上分析，糖碳源以蔗糖为碳源发酵较为适宜。

2.2 不同氨基酸氮源对菌株发酵产生物表面活性剂的影响

由图2A、图2B可知，以不同氨基酸氮源发酵时，发酵过程中细胞生长速度和耗糖速度依天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序减小，细胞最大生长量依谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序减小，细胞最大生长量所需时间依谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序延长，而耗糖量依天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序减少。不同氨基酸氮源均在发酵的前2天菌体快速生长，随后减慢，只有谷氨酸氮源发酵仍快速生长，并于发酵3 d达最大生长量。由图2C可知，不同氨基酸氮源的发酵液乳化活性升高速度依天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序减少；乳化活性升高幅度依天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、缬氨酸的顺序减少（依次为54%、49%、24.5%、12%、12%），差异显著；乳化活性升高至最大所需时间依天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、缬氨酸的顺序减少。以天冬氨酸为氮源发酵4 d的发酵液乳化活性最大（54%），随后下降，可能是由于发酵液中糖含量过低，致使所产生物表面活性剂被菌体利用。由图2D可知，不同氨基酸氮源的发酵液初始表面张力就有差异，依谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、赖氨酸、精氨酸的顺序减少，在不同发酵时间的顺序有别，下降幅度较小，且彼此差异不显著。相比硝酸钠氮源（见2.1），使用天冬氨酸氮源时，菌体生长更快更多，提前1天达到略低的最大乳化活性，而其他氨基酸氮源的发酵液乳化活性明显低。

图2 不同氨基酸氮源发酵产生物表面活性剂时总糖或甘油（A）、细胞生长量（B）、乳化活性（C）、表面张力（D）变化Fig. 2 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D)when biosurfactant was produced by fermentation with different amino acids nitrogen sources

结果表明，天冬氨酸氮源发酵的菌体生长和生物乳化剂生成较快较多，使发酵耗糖最快最多，与谷氨酸氮源发酵相比较，其最大细胞生长量较小，发酵液乳化活性却较早升至最高，可见，适当限制菌体生长有助于代谢合成生物乳化剂。天冬氨酸氮源发酵2 d后的菌体生长减慢，可能是大量合成生物乳化剂以及糖含量降低之故。谷氨酸氮源不仅促进细胞生长，还因有助于前体物质合成而促进生物乳化剂合成，提高细胞对氮源的利用率[26]，又因较大程度促进生长而使发酵液乳化活性低于天冬氨酸氮源发酵液。赖氨酸、精氨酸和缬氨酸氮源的菌体生长量较低，不利于产生物乳化剂。可能与相同氮素含量下天冬氨酸和谷氨酸分子含有较多的碳素有关，还需进一步考察。综上分析，天冬氨酸比其他氨基酸更适于作为生物乳化剂发酵的氮源，而接近硝酸钠氮源的发酵效果。

2.3 不同碳氮比对菌株发酵产生物表面活性剂的影响

由图3A可知，以不同碳氮比发酵时，发酵过程中发酵液的总糖浓度随发酵时间延长而下降，耗糖量随C/N增大而增大。在本研究的C/N 水平，C/N为1的菌体生长量最小，C/N为30的菌体生长最快最多，明显比C/N为40的生长快且多（图3B）。可见，碳源浓度较低会限制生长，较高会抑制生长。如图3C所示，C/N在10、20和30发酵4天的发酵液表现出最大乳化活性（依次为55.75%、54.95%、54.78%），彼此差异不显著；C/N在1和40的发酵液乳化活性升高较晚，且显著低于其他C/N发酵液的乳化活性（分别为19.73%、46.00%），说明过高和过低的C/N均不利于合成及积累生物乳化剂。不同C/N的发酵液表面张力均在发酵2 d降至最低（图3D，56～59 mN/m），降低幅度很小且无显著差异，说明生物表面活性剂生产几乎不受C/N影响，主要由实验菌株代谢特性决定。C/N为1的菌体生长量以及耗糖均较少；C/N为40耗糖和残留糖均较多，糖碳源不能有效地用于菌体生长和生成生物乳化剂。C/N在10、20、30的发酵液乳化活性升高较快较多，且乳化活性较稳定，残糖较低，其中C/N为10的发酵液残糖及菌体生长量均较低，乳化活性最大，达到55.75%，说明产生的还原糖被较快较多地用于合成生物乳化剂。

图3 不同碳氮比发酵产生物表面活性剂时总糖或甘油（A）、细胞生长量（B）、乳化活性（C）、表面张力（D）变化Fig. 3 Changes of total sugar or glycerol (A), cell growth amount (B), emusifying activity (C), surface tension (D) when biosurfactant was produced by fermentation with different carbon and nitrogen ratio

综上所述，碳氮比过高和过低均不利于菌体生长和生物表面活性剂合成，选择C/N为10发酵产生物乳化剂，既利于菌体生长和生物表面活性剂合成，也利于有效利用碳源，降低生产成本。

3 结论

实验菌株Ochrobactrumsp. XY-1以4 g/L硝酸钠为氮源，可以利用10 g/L的蔗糖、乳糖、甘油、木糖、果糖生长并合成生物乳化剂，蔗糖碳源的菌体生长较快较多且高产生物乳化剂，发酵5 d达最大乳化活性56.3%；虽然乳糖碳源的菌体生长较差，但有利于合成生物乳化剂和生物表面活性剂。以10 g/L蔗糖碳源并分别以相同氮含量（0.05 mol/L）的谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸和缬氨酸为氮源，也表现出生长和合成生物乳化剂，以天冬氨酸和谷氨酸为氮源较突出，且天冬氨酸比谷氨酸氮源发酵的细胞生长量小，发酵液乳化活性较快（发酵4 d）升至最高（54%）。使用天冬氨酸氮源比硝酸钠氮源的菌体生长更快更多，提前1天达到略低的最大乳化活性。以蔗糖为碳源，在C/N为10的菌体生长较少，但乳化活性达到最大55.75%。跟同类研究比，本实验菌株发酵液的乳化活性不高，发酵较慢，可以通过优化培养条件得以改善。今后应进一步研究更多水溶性和水不溶性碳源的发酵特性以及不同碳源和氮源的组合发酵效果，并对所产生物乳化剂进行提取和化学组成分析，建立构效关系。