福建省铁皮石斛茎腐病病原菌鉴定及其生物学特性

姚锦爱，黄 鹏，兰成忠，侯翔宇，余德亿

（福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/福建省农业科学院植物保护研究所/福建省作物有害生物绿色防控工程研究中心，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意义】铁皮石斛（Dendrobium officinale）属于兰科石斛属的多年生草本植物，富含多种生物碱、石斛多糖、氨基酸、菲类化合物以及微量元素等，具有益胃生津、滋阴清热、增加免疫力等作用，是一种非常珍贵的中药材[1]。目前福建、安徽、浙江、江苏、云南、广西和广东等省是铁皮石斛人工栽培的主产区。由于生长环境条件改变和大棚集约化的生产模式，其病虫危害日益加重，对铁皮石斛种植造成重大威胁。【前人研究进展】茎腐病是铁皮石斛发生最严重的病害之一。目前报道的引起铁皮石斛茎腐病的病原菌主要有镰刀菌（Fusariumspp.）、疫霉菌（Phytophthora nicotianae） 以及立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），其中由镰刀菌引起的茎腐病田间发病率较高，致病性强，防治难[2−5]。镰刀菌属内的多个种对铁皮石斛根茎部均可致病，而因地域环境、栽培方式、气候条件等的差异，铁皮石斛茎腐病主要致病菌种类也存在差异。【本研究切入点】引起福建省铁皮石斛茎腐病的病原真菌种类有待深入探讨。【拟解决的关键问题】为了进一步明确福建省铁皮石斛茎腐病的主要病原真菌，以该地区铁皮石斛种植基地茎腐病病株为研究对象，通过症状观察、形态学及ITS、ACT、EF1-α、RPB2和LSU等基因序列分析，结合致病性测定准确鉴定福建省铁皮石斛茎腐病的病原菌，以期为铁皮石斛主要病害如茎腐病和根腐病等的高效防治提供依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物：铁皮石斛病株采自福建省诏安县和松溪县的铁皮石斛种植基地。健康铁皮石斛苗购自种植基地。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，补蒸馏水定容至1 L；察氏（Czapek）培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂粉16 g，添加蒸馏水定容至1 L。

试剂：植物基因组DNA 提取试剂盒，天根生化（北京）科技有限公司；TaqDNA 聚合酶、dNTPs和琼脂糖，生工生物（上海）工程股份有限公司。

仪器：Nikon E200 光学显微镜（Nikon，日本）；C1000 Thermal Cyclers 型 PCR 仪（Bio-Rad， 美国）；DYCP-31DN 型琼脂糖水平电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 铁皮石斛茎腐病田间发病症状观察 2019-2020 年在福建省诏安县和松溪县等多个铁皮石斛种植基地对茎腐病发生条件及发病症状进行观察。

1.2.2 病原菌的分离纯化与形态学鉴定 选取感病铁皮石斛发病部位，在病健交界处用灭菌解剖刀取大小为0.5 mm×0.5 mm 的小块，置于70 %酒精中30 s，后用无菌水冲洗2～3 次，于无菌滤纸上晾干后平放PDA 平板中央，26 ℃培养。2 d 后分离物上长出白色菌丝，显微镜下观察挑取单孢接种于新的PDA 平板上中央，26 ℃继续培养5～7 d 后，挑选分离所得代表菌株（编号FJDO-1 和FJDO-2）在显微镜下对菌丝和孢子进行观察，镜检30 个视野。

1.2.3 致病性测定 在培养7 d 的菌株（编号FJDO-1）菌落上，用无菌打孔器取直径为5 mm 的菌饼，同时用灭菌1 mL 注射器针头在10 个离体茎秆上分别轻轻刺伤1～3 个小口，将菌饼置于刺伤伤口表面上，并用无菌水浸湿的棉花包裹（图1-D），进行病原菌致病性测定。以只接种PDA 培养基为空白对照。接种7 d 后，对铁皮石斛发病部位进行病原菌再次分离和鉴定，观察与原接种菌的性状特征，发病症状是否一致。

图1 铁皮石斛茎腐病的症状及病原菌的形态Fig. 1 Symptom and morphology of stem rot on D. officinale

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 参照Yao 等[6]的方法，对代表菌株（编号FJDO-1）基因组DNA 进行PCR扩增。根据真菌基因组DNA 提取试剂盒的说明书提取DNA。采用ITS基因、ACT基因、EF1-α基因、RBP2 基因和LSU基因引物（表1），分别对病原菌基因组DNA 进行PCR 扩增。PCR 反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min（ITS），72 ℃延伸1.5 min，35 个循环；最后72 ℃延伸8 min，ACT和EF1-α基因PCR 反应程序的退火温度分别为58 ℃和56 ℃，其余基因扩增的退火温度与ITS相同。PCR 产物经琼脂凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序；为了进一步揭示该菌株的分类地位，将获得的核酸序列在NCBI 的BLAST 中进行同源性比对分析[7]，使用PhyloSuite 1.2.1 对上述5 个不同基因序列进行串联[8]；用PartitionFinder 2 确定的最佳数据分区[9]，最后用MEGA 6.0 软件进行多基因系统发育分析[10]。

表1 茎腐病菌鉴定所用 PCR 引物Table 1 PCR primers for pathogenic identification of stem rot disease

1.2.5 病原菌生物学特性研究 （1）温度对病原菌菌丝生长的影响。在纯化培养5 d 的病原菌边缘取直径5 mm 的菌饼转接于PDA 培养基中央，分别置于10～40 ℃间以5 ℃为梯度（7 个梯度）的恒温培养箱内暗培养6 d，采用十字交叉法测量菌落直径。每处理重复3 次。

（2）pH 对病原菌菌丝生长的影响。取直径为5 mm 的菌饼接种于用0.1 mol·L−1HCl 和0.1 mol·L−1NaOH 调配pH 为4、5、6、7、8、9、10 的PDA 培养基上，后置于28 ℃恒温培养，6 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3 次。

（3）光照条件对病原菌菌丝生长的影响。取直径为5 mm 的菌饼转接于PDA 培养基中央，分别置于黑暗、光照和黑暗光照交替（12 h/12 h）3 种不同光照条件下，26 ℃恒温培养，6 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3 次。

（4）碳源对病原菌菌丝生长的影响。在察氏培养基配制配方的基础上，将培养基中的蔗糖替换为等量的淀粉、麦芽糖、乳糖、葡萄糖，配制成含不同碳源的培养基，以不含碳源培养基作为空白对照；再将5 mm 的活化菌饼接于不同碳源培养基中央，26 ℃恒温培养，6 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3 次。

（5）氮源对病原菌菌丝生长的影响。取察氏培养基配制配方的基础上，将培养基中的硝酸钠替换为等量的蛋白胨、牛肉浸膏、酵母、硫酸铵，配制成不同氮源的培养基，以不含氮源培养基为空白对照。再将5 mm 的活化菌饼接于不同氮源培养基中央，26 ℃恒温培养，6 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3 次。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛茎腐病症状

调查发现铁皮石斛茎腐病在夏季高温高湿的环境中易发生。幼苗或新发枝感染时，植株下部叶片失绿变黄，茎秆黄化、萎蔫、枯萎（图1-A），随着时间的推移病斑逐渐向上蔓延，叶片出现萎蔫下垂、变褐等症状，严重的开始脱落、皱缩，最后整株黄化枯萎。茎秆基部或中部呈水渍状的病斑，后变黄干枯缢缩，湿度大时病株茎基部可见白色或粉红色霉状物。

2.2 病原菌的形态特征及致病性

代表菌株FJDO-1 在PDA 培养基上生长良好，菌落呈圆形，正面可观察到气生菌丝茂盛，初期菌落为白色，渐变为淡紫色，羊毛状，边缘整齐，背面可观察到同心不规则轮纹，中央紫色色素较为集中(图1-B)。光学显微镜观察，可看到菌株FJDO-1的菌丝白色透明、有分枝和分隔，分生孢子有的呈镰刀形，有的呈豆荚状，透明，大多数具2～5 个横隔，其大小为（19.8～39.2）μm×（2.9～4.3 μm）(图1-C)。植株接种菌株 FJDO-1 菌丝块7 d 后，可看到接种部位均出现带有水渍状的病斑，随后茎秆皱缩，与田间自然发病植株症状完全相同(图1-E、F)；而对照没有出现发病症状。从接种发病的植株茎秆上取发病部位进行再分离纯化，获得1 株与原接种菌株在培养性状和形态特征上一致的病原菌，进一步确定菌株FJDO-1 为铁皮石斛茎腐病病原菌。

2.3 菌株FJDO-1 的分子鉴定

选取ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU基因序列对菌株FJDO-1 基因组DNA 进行PCR 扩增，分别得到大小为517、227、682、1178、565 bp 的片段。通过测序后将获得的序列在GenBank 基因库中进行比对，发现菌株FJDO-1（ITS、EF1-α、ACT、RPB2 和LSU序列登录号分别为MK880499、MK895954、MW546934、MZ031970 和MZ031390），与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum（ITS、EF1-α、ACT、RPB2 和LSU序列登录号分别为MG198889、 LT841228、MH828025、MT305136 和JN938909）的同源性均达99 % 以上。 将获得的MK880499、 MK895954、MW546934、MZ031970 和MZ031390 序列与GenBank中同源性较高的种的序列构建多基因系统发育树（表2，图2），发现在多基因系统发育树上，菌株FJDO-1 与尖孢镰刀菌聚为一支，其遗传距离最近，结合形态学特征、致病性测定结果和分子生物学鉴定结果确定引起铁皮石斛茎腐病的病原菌为尖孢镰刀菌F. oxysporum。

图2 基于ITS/ACT/EF1-α/RPB2/LSU 基因序列采用邻接法构建的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree based on sequences of ITS/ACT/EF1-α/RPB2/LSU genes using neighbor-joining method

表2 基于ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU 基因系统发育树登录序列Table 2 Sequences of ITS, ACT, EF1-α, RPB2, and LSU genes for construction of phylogenetic tree

2.4 病原菌生物学特性

2.4.1 温度对病原菌菌丝生长的影响 如图3 所示，病原菌在15～40 ℃条件下均能生长，15～30 ℃时，菌丝生长速度呈升高趋势，30～40 ℃时，菌丝生长速度呈下降趋势。菌丝适宜生长温度为25～30 ℃，在30 ℃时，菌丝生长最快，培养6 d 菌落直径为80.33 mm。结果表明，该病原菌最适生长温度为30 ℃，不耐低温。

图3 不同温度对病原菌菌丝生长的影响Fig. 3 Effect of temperatures on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.2 pH 对病原菌菌丝生长的影响 如图4 所示，病原菌在pH 4～11 条件下均能生长，当pH 为4～7 时菌丝生长速度呈升高趋势，pH 8～11 时菌丝生长速度呈下降趋势。菌丝适宜生长pH 为7 ～ 8，在pH 为 7 时菌丝生长最快，培养 6 d 菌落直径为84.33 mm，结果表明，该病原菌喜中性或偏碱性环境，最适生长pH 值为7。

图4 不同pH 对病原菌菌丝生长的影响Fig. 4 Effect of pHs on mycelial growth of F. oxysporum

2.4.3 光照条件对病原菌菌丝生长的影响 如图5 所示，病原菌在不同光照条件下均能较好地生长，培养 6 d 菌落直径分别为65.67 、74.00 和80.67 mm，具有差异显著，病原菌在全光照条件下菌落直径最大，说明该病原菌喜光照。

图5 不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响Fig. 5 Effect of light conditions on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.4 碳源对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在供试的5 种碳源中都可有效生长。其中乳糖、麦芽糖和葡萄糖为碳源的菌丝生长速度与缺碳源的对照组差异不显著，以淀粉和蔗糖为碳源的菌丝生长速度显著高于不含碳源的空白对照组，以淀粉为碳源的培养基菌落生长最快，培养6 d 后菌落直径为73.67 mm，结果表明淀粉是病原菌菌丝生长的最佳供试碳源（图6）。

图6 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响Fig. 6 Effect of carbon sources on mycelial growth of F.oxysporum

2.4.5 氮源对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在供试的5 种氮源中都可有效生长，且差异显著。其中以酵母为氮源的菌丝生长速度高于不含氮源的空白对照组，以蛋白胨为氮源的培养基菌落生长最快，培养6 d 后菌落直径为74.67 mm，结果表明蛋白胨是病原菌菌丝生长的最佳供试氮源（图7）。

图7 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响Fig. 7 Effect of nitrogen sources on mycelial growth of F.oxysporum

3 讨论与结论

本研究通过形态学，结合ITS、ACT、EF1-α、RPB2 和LSU等5 个基因序列分析鉴定了引起铁皮石斛茎腐病的病原菌为尖孢镰刀菌。目前，关于铁皮石斛茎腐病病原菌报道的种类较多，赵桂华等[16]通过形态学和ITS序列鉴定江苏省铁皮石斛茎腐病菌为可可球二孢（Lasiodiplodia theobromae）；孙惠芳等[17]通过形态学和ITS序列鉴定云南大理铁皮石斛茎腐病菌为茄病镰孢菌（F. solani）；王国荣等[18]通过形态学和ITS序列鉴定浙江省杭州市萧山区、义乌市和乐清市等地铁皮石斛茎腐病菌为尖孢镰刀菌（F.oxysporum），但是该病原并未造成维管束变色，与本研究结果不一致；曹星星[19]通过形态学和ITS及EF1-α基因序列鉴定浙江省永康市铁皮石斛茎腐病菌为砖红镰孢菌（F. incarnatum）和层出镰孢菌（F.proliferatum）；曹瑱艳等[1]认为厚垣镰刀菌为浙江省金华市武义县铁皮石斛根腐病的主要致病菌；李梦娇[20]通过形态学和ITS序列鉴定云南省德宏州铁皮石斛茎腐病菌为尖孢镰刀菌（F. oxysporum），该病原可造成植株维管束变色，与本研究结果一致。

杨成前等[21]研究表明，尖孢镰刀菌菌丝生长最适温度为25～30 ℃，最适pH 为7，菌丝生长最适碳、氮源分别为蔗糖和甘氨酸。曹兴等[22]指出尖孢镰刀菌菌丝生长最适温度为25 ℃，最适pH 值为5，最适碳源和氮源分别为乳糖和硝酸钠，在12∶12 光暗交替条件下菌丝生长最快。蒋欣东等[23]研究表明，尖孢镰刀菌菌丝生长最适温度为25～30 ℃，最适pH 为10，在不同光照条件下生长趋势差异不大。敬雪敏等[24]研究指出尖孢镰刀菌菌丝生长最适温度为25 ℃，pH 为7，最适碳源分别为可溶性淀粉和麦芽糖，最适氮源分别为尿素和蛋白胨，完全黑暗条件适于菌丝生长。本研究结果表明，病原菌在15～40 ℃条件下均能生长，适宜生长温度为25～30 ℃，最适为30 ℃，最适pH 为7，这与杨成前等[21]研究结果基本一致；最适碳氮源分别为淀粉与蛋白胨，这与敬雪敏等[24]研究结果基本一致；光照有利于菌丝生长，这与以上结论存在差异，说明不同寄主上的尖孢镰刀菌具有一定生物学上的差异，可成为下一步研究的方向，并且有关引起铁皮石斛茎基腐病病原菌尖孢镰刀菌的侵染机制和病害防治措施等方面仍需进一步研究。