miR-638靶向下调MACC1抑制胃癌细胞的恶性进展

吴现磊，秦二云，孟 妍，张令巧

（濮阳市油田总医院消化内科，河南濮阳 457001）

胃癌（gastric carcinoma，GC）是全世界第6大常见癌症和第2大癌症致死原因[1]。GC的早期诊出率较低，大多数GC患者五年生存率不足20%[2,3]。尽管GC的治疗手段在不断发展，但现阶段临床上GC的一线治疗依然以手术和化疗为主。靶向治疗可能是缓解GC疾病负担的重要途径[4]。因此，探究调控GC细胞发生发展的分子学机制，进而寻找GC中存在潜在治疗作用的靶点，具有重要的临床意义。

MicroRNAs（miRNAs）通过特异性结合靶标的3'端非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）端来抑制基因表达，介导靶标mRNA降解或抑制靶标mRNA翻译[5]。近年来，miRNAs调控肿瘤发生发展的相关研究越来越多，也包括GC[6,7]。例如，miR-194和miR-93-5p在GC中属于致癌基因，miR-194通过激活wnt信号通路促进了GC的发生发展过程[8]，miR-93-5p则是通过激活Hippo途径增强GC细胞的增殖、迁移和侵袭[9]，两者在GC中均具备治疗潜力。此外，miRNA可作为早期筛查GC耐药患者的生物标志物[10]，例如miR-604低表达大概率指示GC耐药性的存在[11]。上述研究均证实miRNAs和GC发生发展密切相关。

结肠癌转移相关基因1（MACC1），最初被发现是作为原发性和转移性结肠癌的癌基因，其位于7号染色体位置的7p21.1，可通过HGF/MET信号传导通路促进肿瘤增殖、浸润和转移[12-14]。此外，越来越多的研究证明MACC1和其他肿瘤的发生进展也密切相关，如神经胶质瘤[15]，肺腺癌[16]，声门癌[17]和肝细胞癌[18]等。GC组织中MACC1水平较正常组织明显升高，且其表达水平可作为GC预后的独立指标[19,20]。目前关于MACC1在GC中的研究依然比较缺乏。

本研究探究了miR-638在GC细胞中的生物学功能。我们发现，miR-638在GC组织和细胞中的表达显著降低。此外，过表达miR-638可显著抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭能力。更重要的是，我们证明了MACC1是miR-638的直接调控靶点，miR-638靶向下调MACC1抑制GC的发生发展，可能是治疗GC的一个潜在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人胃粘膜上皮细胞GES1（货号：BNCC337969），人胃癌细胞MKN-45（货号：BNCC337682）和MKN28（货号：BNCC341748）均购自北纳生物细胞库。GES1和MKN28培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM（含4mM 左旋谷氨酰胺、丙酮酸钠）培养基，MKN-45培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基。均置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱进行培养。

1.2 细胞转染

取对数生长期的GC细胞接种于6孔板，数量大约控制在转染前一天细胞密度达到50%最佳。按照LipoFiter 3000试剂盒操作说明进行转染，以50nM的最终浓度稀释于500μL无血清培养基中配置转染液。取10μL Lipofectamine 3000稀释于500μL无血清培养基中，室温孵育5 min后分别与各组转染液混匀，共分为4组。miR-mimics组：转染miR-638 mimics；NC-mimics组：转染NC mimics；NC+oe-MACC1组：转染oe-MACC1质粒；miR-mimics+oe-MACC1组：共转染miR-638 mimics和oe-MACC1质粒。孵育20 min后加无血清培养基培养6h，弃去原培养基，换成10%血清的培养基进行转染。转染结束后将GC细胞细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱进行常规培养。转染24 h后可用于后续实验研究。

1.3 qRT-PCR

胰酶消化各实验组细胞后，使用Trizol溶液裂解细胞，按照RNA试剂盒操作说明提取总RNA，按照TaqMan的逆转录试剂盒说明书操作说明，将RNA逆转录成cDNA。按照qSYBR-Green-containing PCR kit（Qiagen，USA）操作说明进行操作，在BioRad IQTM5Multicolor 实时荧光定量系统对各实验组细胞进行qRT-PCR。分别以U6和GAPDH作为miR-638和MACC1的内参，2-ΔΔCt用以计算相对表达量。每组重复3次。引物序列见附表。

附表 引物序列

1.4 Western blot

胰酶消化处于对数生长期的各实验组细胞，裂解液裂解细胞后提取总蛋白。使用二喹啉甲酸（BCA）法测定总蛋白。取10 μg样品99 ℃下加热5 min高温变性，进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室温下用5%脱脂奶粉封闭30 min后，加入稀释的一抗MACC1（Abcam，Cambridge，UK）和GAPDH（Abcam，Cambridge，UK），4 ℃下孵育过夜。Tris盐酸缓冲液（TBST）洗膜3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG（Abcam，Cambridge，UK），室温黑暗条件下孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，加入ECL发光剂进行发光反应并保存条带图片，使用ImageJ软件对条带灰度进行定量。每组重复3次。

1.5 CCK8

收集处于对数生长期的各实验组细胞，进行胰酶消化，加入完全培养基重悬并调整细胞密度为2.5×103个/mL，96孔板中每孔接种5000个细胞，边缘孔填充无菌PBS。根据CCK8试剂盒操作说明进行检测，每孔加入10 μL CCK-8溶液后，于37 ℃，5% CO2恒温培养箱培养3h后，通过酶标仪测量其450 nm处的吸光值。每组重复3次。

1.6 划痕愈合

所有器械均进行提前灭菌，直尺和marker笔需要在超净台的紫外台中照射 30 min进行灭菌处理，预先在6孔板背面用marker笔和直尺均匀画横线进行标记，每孔至少标记5条直线。各实验组细胞经胰蛋白酶消化后接种于6孔板中，每孔加入5×105个细胞，每组设置3个复孔。次日使用100 μL无菌移液管枪头垂直于背后横线并经过孔中心进行划痕画一条线，PBS清洗细胞3次，加入无血清培养基置于37℃、5% CO2的恒温培养箱继续培养，在培养0h和24h时于取样拍照记录，使用Image J软件计算24h时各实验组的细胞迁移率，用以评估GC细胞迁移能力的差异。

1.7 Transwell

铺加基质胶稀释液到transwell小室中，于37℃，5%CO2恒温培养箱培养4 h后成膜。胰蛋白酶常规消化各实验组细胞，吸弃培养液后加入含BSA的无血清培养基进行重悬，上室加入200 μL细胞密度为1×105个/mL的GC细胞悬液，下室加入500 μL含血清的完全培养基，于37℃，5% CO2恒温培养箱培养24 h。取24孔板，每孔加入600 μL 4%多聚甲醛，取出小室并清除残留培养液，轻轻放入24孔板固定15 min，用湿润的棉签轻轻擦去上室膜内侧细胞，将小室反转晾干。取空白的24孔板，每孔加入600 μL 0.1%结晶紫甲醇染液，放入小室染色30 min后取出，PBS清洗残留染液，放在倒置荧光显微镜下观察拍照并计数。每组重复3次。

1.8 流式细胞术周期分析

收集处于对数生长期的各实验组细胞，于无血清的培养基培养24 h后进行胰酶消化，可收获同步化的G0期细胞。将各实验组细胞接种于96孔板中，每孔大约5000个细胞，经预冷的PBS清洗两次后，加入3.5 mL预冷的75%冰乙醇轻柔混匀固定，在4℃冰箱过夜。1500 rpm离心5 min后弃上清，经预冷的PBS再次洗涤清除乙醇，加入0.2 mg糖酸酶 A（RNase A）和1 mL PI/Triton X-100染色液（20 μg PI/0.1% Triton X-100），37℃避光水浴30 min，经流式细胞仪（Beckman）检测细胞周期，通过ModFit LT 4.1软件进行分析。每组重复3次。

1.9 双荧光素酶实验

将含有miR-638结合位点的MACC1的3'-UTR克隆到pGL3荧光素酶报告载体（Promega，Madison，WI，USA）中。使用Quick-change site-directed mutagenesis kit（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）对结合位点进行突变。然后参考细胞转染步骤将构建的载体分别与miR-638 mimic或NC-mimic共转染到GC细胞。在37℃，5% CO2的恒温培养箱中培养48 h后，使用裂解液裂解细胞。按照荧光素酶检测试剂盒操作说明书，经单光子检测仪（Biorad，USA）检测荧光素酶活性。每组验重复3次。

1.10 统计学分析

本研究使用GraphPad Prism 8.0进行制图，Image J、ModFit和SPSS 26.0进行实验数据的统计分析，所有数据均以mean±sd的形式表示，两组数据比较采用t检验，多组数据比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-638在GC细胞中显著低表达

TCGA的GC数据集显示miR-638在GC组织中显著低表达（图1A），miR-638的低表达与GC患者预后不良显著相关（图1B）。随后，qRT-PCR结果同样显示miR-638在GC细胞中的表达水平显著下调（图1C）。综上，miR-638在GC细胞中显著低表达。

图1 miR-638在GC细胞中低表达

2.2 过表达miR-638抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长

为了探究miR-638在GC中的调控作用，我们对各处理组GC细胞进行CCK8、划痕愈合、transwell和流式细胞实验。首先，通过qRT-PCR实验验证单独转染miR-mimics使得GC细胞中的miR-638表达量显著升高（图2A）。相比于NC mimics组GC细胞，CCK8实验发现miR-mimics组的GC细胞活力显著降低（图2B、2C）；划痕愈合和Transwell表明miR-mimics组的GC细胞的迁移率和侵袭细胞数目显著降低（图2D、2E）；细胞周期结果显示，过表达miR-638显著上调了GC细胞的G1期比例（图2F），表明GC细胞生长受到抑制。综上，过表达miR-638抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长。

图2 miR-638抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长

2.3 miR-638直接靶向MACC1

TargetScan数据库显示，miR-638和MACC1存在结合位点（图3A）。双荧光素酶报告基因实验结果也表明，过表达miR-638显著抑制MACC1野生型的荧光素酶活性，而对MACC1突变型未产生显著影响（图3B、3C）。qRTPCR表明GC细胞中MACC1显著高表达（图3D）。qRT-PCR和western blot实验发现，过表达miR-638抑制GC细胞中的MACC1的表达水平（图3E）。总结上述实验，证实GC细胞中，MACC1是miR-638的直接靶点，miR-638负调控MACC1。

图3 miR-638靶向抑制MACC1

2.4 miR-638靶向下调MACC1抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长

qRT-PCR和western blot结果表明，仅转染oe-MACC1时，GC细胞中MACC1的表达水平显著上调，而同时过表达miR-638后，GC细胞中MACC1的表达水平和NC-mimics组无明显差异（图4A）。比较3组处理组GC细胞的细胞功能学实验结果，发现相比于NC-mimics组，单独过表达MACC1后，GC细胞的OD值、迁移率和侵袭细胞数目均显著升高，GC细胞的G1期比例显著降低，同时过表达miR-638和MACC1时，GC细胞的OD值、迁移率、侵袭细胞数目和G1期比例均与NC-mimics组无明显差异（图4B～4F）。综上所述，MACC1能够促进GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长，而miR-638能够逆转MACC1的促癌作用。

图4 miR-638靶向下调MACC1抑制GC细胞的增殖、迁移、侵袭和生长

3 讨论

GC作为最常见的恶性肿瘤之一，目前仍缺乏预后较为理想的治疗方案。随着靶向治疗相关研究的不断丰富，近期有关miRNAs在GC中靶向治疗的报道也逐渐增多，对GC治疗有所裨益[21]，因此研究miRNAs用于GC的靶向治疗备受临床关注。

之前的报道证实miR-638在GC组织和细胞中的表达显著降低[22]，本研究也表明miR-638在GC细胞显著低表达。本研究通过一系列细胞功能实验探究miR-638在GC中的调控作用，发现过表达miR-638抑制了MKN-45和MKN28细胞的增殖、迁移、侵袭和生长，这与先前Shen等人的研究结论达成一致[22]。

MACC1和miR-638存在结合位点，此外，MACC1是促进GC生长和转移的致癌基因[23]，也能够调节GC细胞中的PDL1表达和肿瘤免疫力，表明MACC1可能是GC的治疗靶点[24]。本研究证实，GC细胞中MACC1的显著高表达后，通过双荧光素酶实验验证了MACC1是GC细胞中miR-638的靶基因。随后的一系列细胞功能实验表明，miR-638能够逆转MACC1对GC细胞增殖、迁移、侵袭和生长的促进作用，即miR-638通过靶向下调MACC1的表达抑制GC细胞增殖、迁移、侵袭和生长，证实miR-638是通过与GC细胞中的MACC1特异性结合，进而发挥其调控作用。

总之，本研究证实了GC细胞中的miR-638表达下调，MACC1表达上调，经实验验证了miR-638靶向MACC1发挥对GC细胞发生发展的抑制作用。综上，本研究认为MACC1和miR-638对GC细胞的调控机制，可为GC的靶向治疗提供另一条有希望的途径。