HLA-DRB1*04位点下IL-34和CSF-1表达水平对广西肝癌家族聚集性的影响*

李晓晴，李国坚，吴健林，彭金林，劳晓洁

(广西医科大学第一附属医院，南宁 530021)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国肿瘤致死病因第2 位[1]。广西是HCC高发区之一，HCC 高发的同时存在明显的家庭聚集现象，发生2 例及以上HCC 的家庭占HCC 家庭的33.9%[2]。本课题前期研究结果表明，机体的遗传因素（HLA-DRB 等位基因）[3-5]和机体的免疫状态[6-8]等因素与广西HCC 发病密切相关，携带HLA-DRB1*04可能与广西HCC 高发区HCC 家族聚集性存在相关性，而HLA-DRB1*04 等位基因与乙肝病毒（HBV）的感染并无明显相关[3-5]。有研究报道，白细胞介素-34(interleukin-34，IL-34)和集落刺激因子-1(colony stimulating factor-1，CSF-1）可能与HCC 的发生发展密切相关[9-13]。IL-34 和CSF-1 均可以与集落刺激因子-1受体(colony stimulating factor-1 recep‐tor，CSF-1R)相结合而激活不同的信号通路并调控巨噬细胞功能[9]。本研究以HLA-DRB1*04 基因位点对广西HCC 家族聚集性作用研究为基础[3]，进一步探讨CSF-1 和IL-34 表达水平以及HLA-DRB1*04 基因位点下CSF-1 和IL-34 表达水平对广西HCC家族聚集性的影响，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

从已完成HLA-DRB1*04 基因位点检测的研究对象中收集HCC 高发家族无癌成员51 名作为高发家族成员组。选取广西地区未发生过任何肿瘤的家族成员49 名作为无癌家族成员组。高发家族成员组纳入标准：（1）直系血亲中发生过2例及以上肝癌患者的HCC 家族成员；（2）本身未发生过任何肿瘤；（3）已完成HLA-DRB1*04 基因位点检测。排除标准：（1）有丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、丁型肝炎病毒和戊型肝炎病毒感染史；（2）有酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝病等肝病病史。（3）不能配合本研究者。两组一般资料相比较，差异无统计学意义，具有可比性，见表1。本研究通过本院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 样本采集及处理方法 采集研究对象空腹外周静脉血液标本3 mL置于普通干燥无菌试管内，室温血液自然凝固10～20 min，4 °C 离心20 min（2 000～3 000 r/min）。仔细收集上层血清并转移至无菌EP 管进行分装、编号，并置于−80 ℃超低温冰箱冰冻保存待测。

1.2.2 IL-34 和CSF-1 表达水平的检测 应用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术测定所有受检标本外周血IL-34和CSF-1水平。严格按照ELISA 试剂盒(江苏酶免生物技术有限公司) 使用操作方法进行操作：准备试剂，样品和标准品，在酶标包被板上加入准备好的样品和标准品，37 °C 反应30 min，洗板5次，加入酶标试剂，37°C 反应30 min，洗板5次，加入显色液A、B，37°C 显色30 min，加入终止液。15 min 内通过美国伯乐Bio-Rad i Mark 全自动酶标仪测定被测标本吸光度(optical density,OD)值，严格按照全自动酶标仪说明书操作。绘制标准曲线，计算样品浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS22.0 软件处理数据，偏态分布计量资料以中位数(四分位数)［M(P25，P75)］表示，组间比较采用两独立样本Mann-WhitneyU检验；计数资料以百分率（%）表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组IL-34和CSF-1表达水平比较

高发家族成员组IL-34 表达水平显著高于无癌家族成员组(P＜0.05)；高发家族成员组和无癌家族成员组的CSF-1 表达水平相比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

2.2 HLA-DRB1*04 基因位点阳性组和阴性组IL-34和CSF-1的表达水平比较

HLA-DRB1*04基因位点阳性组IL-34和CSF-1表达水平均显著高于阴性组(P＜0.05)。见表3。

2.3 HBsAg阳性组和阴性组IL-34和CSF-1表达水平比较

HBsAg 阳性组IL-34 和CSF-1 表达水平显著低于HBsAg阴性组(P＜0.05)，见表4。

表2 两组IL-34 和CSF-1表达水平比较 pg/mL，M(P25,P75)

表3 HLA-DRB1*04基因位点阳性组和阴性组IL-34和CSF-1的表达水平比较 pg/mL，M(P25,P75)

表4 HBsAg阳性组和阴性组IL-34和CSF-1表达水平比较 pg/mL，M(P25,P75)

3 讨论

HCC 是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其高危因素包括HBV 感染、HCC 家族史等[14]。此外，多种Th1/Th2细胞相关因子亦与广西HCC的家族聚集性密切相关[15]。IL-34 和CSF-1 可通过调控肿瘤相关巨噬细胞的极化和功能，继而影响肿瘤免疫微环境[16]。本课题组前期研究表明，免疫失衡对广西HCC的家族聚集性也起到一定作用[15]，IL-34 和CSF-1 表达水平在广西HCC 高发区中HCC 家庭聚集性的作用如何，以及HLA-DRB1*04 等位基因位点是否通过对细胞因子IL-34 和CSF-1 表达水平的影响从而导致HCC 的家族聚集性发生需要进一步探讨。

本研究通过对HCC 高发家族成员组及无癌家族成员组IL-34和CSF-1表达水平的比较，结果发现HCC 高发家族成员组IL-34 表达水平显著高于无癌家族成员组(P＜0.05)，而CSF-1 表达水平在两组间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。提示IL-34 表达水平与广西HCC 家族聚集性存在一定关系，而CSF-1 表达水平未见与广西HCC 家族聚集性相关，也不除外样本量不足所致。IL-34 和CSF-1 均可诱导巨噬细胞的M2 极化，但在不同的组织细胞中存在表达和功能的差异[17]。IL-34 比CSF-1 诱导产生的M1 极化巨噬细胞表达高水平IL-10 的能力更强[13]，IL-10 可以抑制Th1 细胞的分化和效应器功能[18]，诱导巨噬细胞向M2方向极化，使HCC 高发家族成员免疫微环境可能长期处在一种轻微炎症的状态中，引起外周血清IL-1β 表达升高[7]。IL-1β 可以通过调节核因子-κΒ(NF-κΒ)介导应激细胞中IL-34mRNA 水平，刺激骨髓中单核细胞向巨噬细胞分化[9]。IL-34 在肝组织中持续高表达，血液循环中95%的CSF-1 在肝脏中被巨噬细胞清除[10]，这可能限制了CSF-1在肝脏中功能的发挥，因此表现出IL-34 与广西HCC 家族聚集发生关系可能较CSF-1 更为密切。

本课题组前期研究发现，HLA-DRB1*04 是广西HCC 高发区HCC 易感因子，但可能不是通过提高HBV 的感染率而导致HCC 的发生[3]，至于HLADRB1*04 等位基因是如何导致HCC 的易感，其免疫机理如何有待进一步探讨。国外有研究发现，HLA-DRB1*04基因亦是埃及地区人群HCC发生的危险因素[19]。本研究以前期研究为基础，分析发现HLA-DRB1*04 阳性组IL-34 和CSF-1 的表达水平均显著高于HLA-DRB1*04 阴性组(P＜0.05)。提示IL-34和CSF-1的高水平表达可能受到HLA-DRB1*04 等位基因的影响，HLA-DRB1*04 等位基因通过影响IL-34和CSF-1的高水平表达，引起免疫失衡从而导致HCC 家族聚集性的发生。由于IL-34 和CSF-1 在体内的分布不均，因而在进行HCC 高发家族成员和无癌家族成员比较时IL-34 较CSF-1 与HCC 家族聚集的关系更为密切。有研究发现，携带HLA-DRB1*04 等位基因的人群中促炎因子IL-6 的表达水平升高[20]。在炎症环境中，IL-34具有更强大的促进肝脏Kupffer细胞M2极化的能力[17]，M2极化的Kupffer细胞可以诱导Th2型免疫应答，对炎症刺激不敏感、抗原提呈能力低下导致肝脏非典型增生细胞发生免疫逃逸，进而促进癌前病变向HCC发生发展[21]。

国内外许多研究均已证明HBV 感染与HCC 的发生关系极为密切。本研究发现，HBsAg 阳性组IL-34 和CSF-1 表达水平较HBsAg 阴性组均显著下降(P＜0.05)，提示广西HCC 高发家族成员在HCC发生的过程中，HBV 的感染并不是通过提高IL-34和CSF-1 高水平表达而引起HCC 的易感，也表明IL-34和CSF-1导致HCC易感可能与HBV感染所起作用的途径各异，可能并不存在协同作用。尽管有研究发现，HBV 感染后损伤的肝脏中IL-34 和CSF-1 的表达水平上升，但这可能是肝脏中的Kupffer 细胞及肝星状细胞被慢性激活而非HBV 感染引起的[22]。HCC 癌旁组织较HCC 组织IL-34 表达高，提示IL-34 可以通过介导TAMs 浸润和增殖影响HCC的发生发展[23]。此外，IL-34 还可能通过miR-28-5p-IL-34-TAMs反馈环，调节HCC的转移和进展[21]。这些研究结果提示，在广西HCC 发生的过程中除了HBV 感染的作用外，遗传因素通过对细胞因子的影响，引起体内免疫微环境状态的变化，从而促进HCC的发生发展。