CEMIP调控Src/AKT/STAT3信号通路对非小细胞肺癌上皮间质转化及细胞侵袭、迁移的影响*

莫小香，黎 骊，黄国林，宋锦静，于 菲，韦彤彤，阳 洁Δ

（1.广西医科大学药学院，南宁 530021；2.广西医科大学第五附属医院药学部，南宁 530022）

近10年来，肺癌的发病率和死亡率在全球所有类型癌症中均位居第一[1-3]。非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）是我国肺癌的主要亚型，其中，85%的肺癌患者属于腺癌[4]。与其他肺癌类型比较，NSCLC 症状隐匿，极易与其他肺部疾病混淆而漏诊，从而导致患者错失手术治疗时机[5]。尽管NSCLC 治疗方式多样，但因其进展迅速，多数患者确诊时已发生远处转移，难以采用手术治疗且对可选择的治疗手段容易发生耐受，平均5 年生存率低，约为15%[3,6-7]。因此，远处转移仍是NSCLC 患者远期生存率低的关键原因，目前抑制NSCLC 转移的治疗方式还十分有限[7-8]。

细胞迁移诱导透明质酸结合蛋白（cell migra‐tion inducing protein，CEMIP）是近年来被发现的一个具有透明质酸（hyaluronan，HA）水解酶活性，调节细胞运动的蛋白[9]。大量研究发现，CEMIP 异常高表达与结直肠癌、宫颈癌、肝癌的发生发展、侵袭、转移呈正相关关系，而鲜少有报道CEMIP对肺癌的影响[10-12]。因此，本研究拟在细胞水平上干预CE‐MIP 的表达，并通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blotting、Transwell等技术检测细胞侵袭、迁移能力、上皮间质转化（epi‐thelial-mesenchymal transition，EMT）标志物的表达变化及其细胞内信号通路的改变，探究CEMIP 对NSCLC侵袭、迁移的影响及其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 NSCLC 细胞株A549、H1299 购自中科院上海研究所细胞库，人正常肺细胞BEAS-2B 购自中科院昆明研究所细胞库；RPMI-1640、胎牛血清购Thermo Fisher Scientific 公司；总RNA 提取试剂RNAiso Plus、逆转录试剂盒（Prime‐Script™RT reagent Kit with gDNA Eraser）、qPCR 扩增染料（TB Green®Premix Ex Taq™II）购自TAKA‐RA 公司；CEMIP 一抗（Proteintech 公司）、GAPDH（BBI公司）、E-cadherin（CST公司）、N-cadherin（Pro‐teintech公司）、Vimentin（CST公司）、Twist1（Protein‐tech公司）、Snail1（Proteintech公司）；STAT3（CST 公司）、Src（Proteintech公司）、p-AKT（CST公司）、AKT（abcam 公司）、Alex-555-羊抗兔（BBI 公司）、羊抗兔、羊抗鼠二抗购自CST公司；CEMIP干扰慢病毒、阴性对照干扰慢病毒购自上海吉凯公司。

1.2 临床标本收集 收集2017 年8 月至2018 年8月广西医科大学附属肿瘤医院收治的6 例NSCLC患者（男4例、女2例，中位年龄66岁）经手术切除的肺癌组织及其癌旁正常肺泡组织。病例纳入标准：（1）年龄大于18 岁；（2）ESCO 得分＜2 分；（3）病理诊断证实为NSCLC 且具有完整的病历；（4）术前未曾接受放、化疗；（5）未合并其他重大疾病。

1.3 免疫荧光染色检测病理组织CEMIP表达情况 将病理切片置于提前预热的烤箱，72 ℃烤片5 h，经过二甲苯－乙醇梯度脱蜡、复水，用柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液（pH=6）进行高压抗原修复，高压上汽5 min 后停止，待其降至室温取出切片。修复后的切片用PBS 洗2 次，然后用5% BSA 室温封闭1 h。按1∶100（CEMIP 抗体∶PBS）比例配置CEMIP一抗稀释液，4 ℃冰箱孵育过夜，次日37 ℃复温1 h，用PBS 洗2 次，加入荧光二抗：Alex555-羊抗兔（1∶100），37 ℃孵育1 h。PBS 洗涤后，加入DAPI 染核5 min，洗涤3 次后切片用甘油封片。在激光共聚焦显微镜（德国徕卡公司，Model DMi8）下观察并拍照，记录CEMIP 染色情况，用Image J软件进行半定量分析。

1.4 细胞培养 NSCLC 细胞株A549、H1299 细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL 青－链霉素的RMPI-1640 培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养、传代。肺正常细胞BEAS-2B 用含0.4%牛脑垂体提取物、0.1%氢化可的松、0.1%重组表皮生长因子、0.1%肾上腺素、0.1%胰岛素、0.1%转铁蛋白、0.1%三碘甲状腺素、0.1%视黄酸的BEBM 基础培养基培养。

1.5 慢病毒转染构建稳定干扰CEMIP 细胞株 将对数生长期的细胞接种到24 孔板，每孔2×104个细胞，每孔加入500 μL RMPI-1640 完全培养基培养。第2 天，吸弃原细胞培养液，用PBS 洗2 次，然后每孔加入500 μL 稀释后的病毒液，病毒滴度为5×106TU/mL，同时设置阴性对照组，37 ℃、5% CO2培养12～24 h 后，吸弃病毒液，用PBS 洗2 次，然后加入500 μL 新鲜RMPI-1640 完全培养基培养。观察细胞状态，必要时给予换液，如果细胞融合度达到80%～90%则将细胞消化转移到25T 培养瓶培养。用荧光显微镜观察细胞GFP 荧光的表达情况，细胞用3 μg/mL 嘌呤霉素持续筛选2 周后，可获得稳定转染细胞株。通过qPCR 和Western blotting 验证所转染细胞株构建成功后，将细胞分为干扰组（shCE‐MIP 组）和转染阴性对照病毒的阴性对照组（shNC组）。

1.6 qPCR 法检测细胞CEMIP mRNA 表达 按照试剂说明书，提取细胞总RNA，反转录成cDNA，用实时定量PCR 仪（ABI 7500，美国）检测CEMIP mRNA 表达水平。CEMIP 上游引物：5’-TCGGTC‐CAAGAGTCCATTC-3’，下游：5’-CTCCATCACCACTAATCTCCC-3’；GAPDH 上游引物：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸34 s，共40个循环；添加熔解曲线：95 ℃10 min，60 ℃15 s，95 ℃5 s。采用2－ΔΔct法计算mRNA相对表达量。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力 迁移实验：将各组细胞预先用无血清培养基饥饿处理12 h。消化收集各组细胞，用无血清RMPI-1640 培养基重悬成5×105个/mL浓度，每孔100 μL分别接种到Transwell 上室，并在下室加入600 μL 含10% 胎牛血清的RMPI-1640 培养基，37 ℃培养24 h 后，取出小室，用棉签擦净滤膜上未转移的细胞，用4%多聚甲醛固定30 min、0.1% 的结晶紫染色30 min，洗净风干，在倒置显微镜下观察(200×)，取8 个视野拍照、计数，取均数。每组设3个复孔。细胞迁移能力用平均细胞数/高倍镜视野表示。

侵袭实验：将Matrigel 原液与无血清RMPI-1640 培养基按1:8 稀释，在Transwell 小室上室加入100 μL 稀释后的Matrigel 基质胶，置于37 ℃培养箱1 h。待上室中的胶凝固后取出小室，消化收集各组饥饿处理后的细胞，用无血清RMPI-1640 培养基重悬成8×105个/mL 浓度，每孔100 μL 分别接种到Transwell上室，并在下室加入600 μL含10%胎牛血清的RMPI-1640 培养基，37 ℃培养24 h 后，取出小室。后续处理及统计与迁移实验相同。

1.8 划痕实验测定细胞愈合能力 预先在6 孔板底部用记号笔每隔0.5～1.0 cm均匀画横线，然后在6孔板中加入各组细胞，每孔5×105个细胞，用完全培养基进行培养。第2 天用10 μL 枪头在孔板底部垂直于背后的横线画痕，PBS冲洗干净后，加入无血清培养基培养，移到10×光镜下观察各组细胞迁移情况，拍照记录。然后放回培养箱培养，必要时更换无血清培养基，并在48 h进行拍照记录。愈合率%=（0 h宽度−48 h宽度）/0 h宽度×100%。

1.9 Western blotting法检测细胞CEMIP、EMT标志蛋白及相关通路蛋白的表达 提取各组细胞蛋白，采用BCA 定量法测定各组细胞蛋白浓度；取30 μg的蛋白进行SDS-PAGE 分离蛋白，将蛋白转移至NC 膜；5%脱脂牛奶室温下封闭1 h 后，分别加入一抗：CEMIP 抗体（1∶800）、GAPDH 抗体（1∶2 000）、Ecadherin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Twist1（1∶500）、Snail1（1∶500）、STAT3（1∶500）、Src（1∶1 000）、p-AKT（1∶2 000）、AKT（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育过夜；PBST 洗膜，分别加入二抗（1∶10 000或1∶30 000）室温下孵育1 h，PBST洗膜，用双色红外成像系统（美国Licor 公司，ODYSSEY）扫膜，Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.10 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CEMIP在NSCLC临床标本中的表达 肺癌组织中CEMIP 的表达明显高于其配对癌旁正常肺泡组织（P＜0.05），约为1.56倍，见图1。

2.2 CEMIP 在肺癌细胞A549、H1299 及肺正常细胞BEAS-2B 的表达 肺癌细胞A549 和H1299 的CEMIP mRNA 及蛋白表达水平均显著高于肺正常细胞BEAS-2B（均P＜0.05），见图2。

2.3 干扰CEMIP后NSCLC细胞中CEMI mRNA及蛋白表达 经嘌呤霉素稳定筛选后，病毒的转染效率均达90%以上。与shNC组比较，shCEMIP组CE‐MIP mRNA 及蛋白表达量均显著降低（均P＜0.001），见图3。

2.4 干扰CEMIP 表达对NSCLC 细胞侵袭、迁移能力的影响 H1299、A549 细胞中shCEMIP 组的迁移、侵袭细胞数均显著少于其shNC 组（均P＜0.01），见图4。

2.5 干扰CEMIP 表达对NSCLC 细胞愈合能力的影响 H1299、A549 细胞中，shCEMIP 组细胞愈合率均显著低于shNC组（均P＜0.001），见图5。

2.6 干扰CEMIP表达对NSCLC细胞EMT的影响 H1299 和A549 细胞shCEMIP 组的上皮标志物E-cadherin蛋白表达量显著高于shNC组（P＜0.05），而间质标志物N-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail1蛋白表达量均低于shNC组（均P＜0.05），见图6。

2.7 干扰CEMIP 表达对NSCLC 细胞转移相关信号通路蛋白的影响 干扰CEMIP 后，H1299 和A549 细胞Src、p-AKT、AKT、STAT3 表达均呈不同程度下降（P＜0.05），见图7。

3 讨论

图1 CEMIP在NSCLC组织样本中的表达

图2 CEMIP在肺癌细胞A549、H1299及肺正常细胞BEAS-2B中的表达

图3 干扰CEMIP后NSCLC细胞中CEMIP的mRNA及蛋白表达

图4 干扰CEMIP表达对NSCLC细胞迁移、侵袭能力的影响

图5 干扰CEMIP表达对NSCLC细胞划痕愈合能力的影响

图6 干扰CEMIP表达对NSCLC细胞EMT标志物蛋白表达水平的影响

图7 干扰CEMIP表达对NSCLC细胞转移相关信号通路蛋白表达的影响

大量研究表明，NSCLC 细胞在一些蛋白、转录因子的驱动下，通过EMT 而获得强大的侵袭、转移能力，发生远处转移。EMT 是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间充质细胞转化的现象[13]。NSCLC 细胞发生EMT 时，表现为失去上皮细胞特性而获得间质细胞特性，如极性消失、呈梭型改变；细胞间粘附减弱、运动能力增强；上皮细胞标记物如E-cadherin 表达下调；间质细胞标记物如N-cad‐herin、vimentin 等表达上调，转录因子Snail、Slug、Twist、ΔEF1/ZEB1、SIP1/ZEB2、E12/E47 等表达增加[13-14]。最近，Yu 等[15]采用免疫组化检测14 对临床标本中YAP1 的表达情况，发现其在具有显著间质表型的NSCLC 癌组织中高表达；Yang 等[16]发现，高表达FOXP3 的NSCLC 能够维持细胞的间质表型，并通过激活Wnt/β-catenin 使细胞具有更强的侵袭、转移及增殖能力。Elumalai 等[17]通过敲除NSCLC细胞中PTEN 表达（PTEN-KO）发现，具有显著间质表型的PTEN-KO 细胞表现出更强的侵袭、迁移能力，并在裸鼠模型上验证PTEN-KO 细胞在体内更易发生远处转移。此外，Jakobsen 等[18]发现，对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）耐药的NSCLC 细胞具有很强的间质表型，且间质标记物的高表达与不良预后呈正相关。相反地，通过抑制EMT 则能够减缓转移的发生。由此可见，EMT表型转化是NSCLC 细胞发生转移的重要过程，EMT与NSCLC的预后、转移有着密切联系。

近年来，大量研究发现，CEMIP 通过调控多种肿瘤细胞EMT 表型转化，驱动其发生远处转移。Xu 等[19]发现，索拉菲尼耐药的肝癌细胞出现明显地间质化，这一现象与其中异常高表达的CEMIP协同EGF 诱导的EMT 转化密切相关。该研究还在裸鼠肝癌耐药模型中证实，高表达CEMIP的耐药细胞更易发生远处转移。具体来说，由于CEMIP含有调控EMT 的高度保守的功能域，这使得其在多种肿瘤中均能促进EMT 进程[20]。此外，一篇CEMIP 与肺癌相关的研究报道，NSCLC 组织中CEMIP 表达水平比正常肺上皮组织明显上调，CEMIP 在研究队列中的强阳性率达49.67%，且高表达CEMIP 与肿瘤低分化、淋巴转移、远处转移呈正相关关系[21]。本研究首先通过检测收集的临床标本，发现CEMIP 在NSCLC 癌组织中的表达显著高于癌旁正常肺泡组织，体外细胞实验采用qPCR 及Western blotting 同样证实了CEMIP 在NSCLC 细胞A549、H1299 中的表达显著高于肺正常细胞BEAS-2B（P＜0.05）。进一步通过干扰CEMIP 表达后发现，NSCLC 细胞的EMT 表型发生逆转，表现为上皮标志物E-cadherin表达上调（P＜0.05），而间质标志物N-cadherin、Vi‐mentin、Twist1、Snail1 的表达下调（P＜0.05），表明CEMIP参与调控NSCLC细胞的EMT表型转变。

研究表明，NSCLC 细胞发生EMT 表型的变化主要受细胞内PI3K/AKT、STAT3 信号通路的调控；抑制NSCLC 细胞中AKT[22]、STAT3[23]等信号通路，可逆转细胞EMT 转化，降低NSCLC 的侵袭迁移能力。Luo等[22]人报道，在NSCLC细胞中使用PI3K抑制剂后，可显著下调其下游AKT、p-AKT 以及mTOR、p-mTOR 的表达，进而降低NSCLC 细胞的侵袭和迁移能力。p-AKT 能够通过激活其下游mTOR 分子，或同时参与调控NSCLC 细胞EMT 转化，从而促进其侵袭迁移[24]。而AKT 的激活依赖于蛋白激酶Src 与AKT 的SH2 功能域结合，使AKT 位于473 位的丝氨酸磷酸化。本研究检测到干扰CE‐MIP 后可引起Src 表达量的降低，且p-AKT 也相应降低（P＜0.05），表明干扰CEMIP 能够通过抑制Src表达，使其对信号蛋白AKT 的激活作用减弱。此外，还发现STAT3 也发生下调（P＜0.05），这可能与其上游p-AKT 表达降低有关，这一结果与Wei 等[25]发现抑制AKT/STAT3 能够降低肾癌转移的报道一致。

综上所述，干扰CEMIP 表达可通过调控NSCLC 细胞中Src/AKT/STAT3 信号通路，抑制其EMT 过程，降低NSCLC 细胞侵袭、迁移能力。本研究提示CEMIP或可成为NSCLC 转移治疗的潜在靶点。