3种实验动物相关病原液相芯片检测方法的建立

黄忠荣，张风荣，费娅绯，林颖峥，张 强，李 健，王 艳

（1.上海海关，上海 200135；2.山东畜牧兽医职业学院，潍坊 261061；3.上海海关动植物与食品检疫局检验技术中心，上海 200135）

实验动物是生物医药研究的基础，被广泛应用于药物评价和毒性实验，微生物、寄生虫和肿瘤学等研究领域。实验动物是替代人类去获取与生命健康息息相关的各种科学实验、产品质量检定、环境检测等数据的重要工具，被称为“活的试剂”、“活的仪器”，为人类健康研究和生命科学发展做出了巨大的贡献[1]。人兽共患病由脊椎动物和人类的共同病原体引起[2]，曾给人类造成了巨大的危害。布鲁菌病（Brucellosis）是一种由布鲁菌引起的人兽共患传染病，患病牛、羊、猪、犬等是人类布鲁菌病的主要传染源[3]；沙门菌（Salmonella）是一类可以引起沙门菌病的人兽共患病原菌，广泛分布于自然界中[4]；弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T. gondii）引起的严重的人兽共患原虫病，可以感染包括人在内的大部分温血脊椎动物，是一种高度流行的人兽共患病[5-6]。已有研究获得弓形虫可溶性GRA1蛋白，对弓形虫的早期诊断具有一定意义[7]。目前对这3种实验动物质量相关病原的快速高通量检测方法的研究与建立还处于空白，高通量检测方法[8]的建立有助于预防实验动物人兽共患病，降低人兽共患病原菌对实验人员的安全威胁。

本研究利用液相芯片高通量的特点，针对以上3种目标病原体基因设计特异性的引物和探针，建立了可同时检测布鲁菌、沙门菌和弓形虫的液相芯片检测方法，该方法的建立对公共安全卫生保障和进出境实验动物检疫具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 阳性对照 含有沙门菌、布鲁菌和弓形虫目的基因的质粒由中国农业科学院上海兽医研究所友情馈赠；含有巴氏通体、弯曲杆菌、狂犬病病毒目的基因的质粒由本实验室保存。

1.2 试剂和仪器 藻红蛋白标记的链霉亲和素（Streptavidin-phycoerythrin，SA-PE）购自美国Invitrogen公司；荧光编码微球Bio-PlexTM200购自美国Bio-Rad公司。

1.3 探针及引物 根据GenBank登录的沙门菌、布鲁菌和弓形虫基因序列，应用分析软件选取最保守的序列（25个核苷酸左右）设计成探针，在5'端标记-NH2，并依据探针设计引物。BruF：5'-biotin-GGCTCGGTTGCCAATATCAA-3'，BruR：5'-CG CTTGCCTTTCAGGTCTG-3'，BruP：5'-NH2-TTT TTTTTTTGACTCCAGAGCGCCCG3'；SalF：5'-A ACGTGTTTCCGTGCGTAAT-3'，SalR：5'-biotin-CCATCAAATTAGCGGAGGC-3'，SalP：5'-NH2-TTTTTTTTTTATGGAAGCGCTCGCAT-3'；ToxF：5'- biotin-CCCTCTGCTGGCGAAAAGT-3'，ToxR：5'-biotin-CCCTCTGCTGGCGAAAAGT-3'，ToxP：5'-NH2-TTTTTTTTTTGAATACACCAAAGTTGCAC AG-3'。引物、探针由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 微球探针的交联 在EP管中加入100 μL相应的微球，5000×g离心10 min后弃上清液，并用灭菌ddH2O洗涤2次；用100 μL 10 mmol/L pH6.0的MES（2-[吗啉]乙基磺酸，2-[N-Morpholino]ethanesulfonic acid hydrate）重新悬浮后，加入20 μmol/L的探针3 μL，振荡混匀后加入15%EDC（1-乙基-3（3-二甲胺基丙基），1-ethyl-3[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride），避光条件下，37℃恒温孵育30 min；离心后弃去上清液，用0.1% SDS洗涤2次后，加入50 μL TE缓冲液（pH8.0）悬浮，即完成微球探针的交联。

1.5 杂交捕获检测 反应体系：取PCR产物5 μL，加入充分混匀后的微球溶液25 μL，4℃条件下孵育3 min，50℃条件下孵育30 min；加入0.2 μg/μL的 SAPE 70 μL，50℃条件下孵育20 min，上机读取平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）值。

1.6 探针特异性的检测 将沙门菌、布鲁菌和弓形虫3种微球混合后进行杂交捕获检测，以确定3种探针的特异性。

1.7 液相芯片检测体系阈值 将20份沙门菌、布鲁菌、弓形虫阴性样品抽提DNA并进行PCR，用于液相芯片检测，计算变异系数，确定本研究建立的液相芯片检测方法的cut-off值。

1.8 液相芯片检测体系特异性 用建立的液相芯片检测体系对含有沙门菌、布鲁菌、弓形虫、狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌目的基因的阳性质粒进行杂交检测，确定建立的液相芯片检测体系的特异性。

1.9 液相芯片检测体系灵敏度 将含有布鲁菌、沙门菌、弓形虫目的基因的质粒分别作5倍（100拷贝/反应）、10倍（50拷贝/反应）、50倍（10拷贝/反应）稀释，验证所建立的液相芯片检测方法的灵敏度。

2 结果与讨论

2.1 探针特异性的检测 3种微球混合后，分别能特异性地检测出布鲁菌（MFI 3183）、沙门菌（MFI 1221）、弓形虫（MFI 6025）的目的基因片段，而检测狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌3种病原体的目的基因的MFI值极低，均为阴性，表明设计的探针具有良好的特异性。

2.2 液相芯片检测体系阈值的确定 将20份均未被沙门菌、布鲁菌、弓形虫感染的阴性样品经DNA抽提后进行PCR扩增，所得产物用于液相芯片检测。根据测得的MFI的均数和标准差来计算阈值（表1），其计算公式：85.4+3×12.56=123.08。

表1 液相芯片检测体系阈值Table 1 MFI results of liquichip technique

2.3 液相芯片检测体系的特异性 采用单对引物的扩增产物筛选出特异性较好的探针后，对建立的液相芯片检测方法进行特异性检测（表2）。混合的3种探针可针对布鲁菌、沙门菌和弓形虫的目的基因进行有效地识别捕获，且对其他狂犬病病毒、巴氏通体、弯曲杆菌3种病原体的目的基因无明显的信号（其MFI值均低于阈值123.08），表明建立的液相芯片检测方法具有较好的特异性。

表2 液相芯片检测体系特异性结果Table 2 The specificity test results of liquichip technique

2.4 液相芯片检测体系灵敏度 利用建立的液相芯片检测方法对浓度系列稀释的DNA模板进行检测（表3）。结果显示，所建立的液相芯片检测方法灵敏度为50拷贝/反应。本研究利用液相芯片高通量的特点，将PCR方法与液相芯片相结合，针对布鲁菌、沙门菌、弓形虫3种病原体的目的基因设计特异性的引物和探针，建立了一种实验动物相关病原体快速高通量检测方法，同一反应管中可同时检测出3种重要的人兽共患病病原，免去了普通PCR过程中需要进行凝胶电泳的繁琐步骤，提高了检测效率，对公共安全卫生、进出境实验动物检疫具有重要的指导意义。于博等[9]建立了布鲁菌RPA-LFD检测方法，其灵敏度可达10拷贝/μL；袁淑萍[10]等建立了猪弓形虫实时荧光PCR检测方法，其灵敏度可达10拷贝/μL；郭澍强等[11]建立了沙门菌LAMP快速检测方法，其灵敏度可达10 CFU/mL；本研究所建立的液相芯片检测方法的灵敏度为50拷贝/反应，其灵敏度稍低于其他单个检测方法，同时由于该方法只涉及了3种病原体，其高通量的优点并未充分体现，后续实验中可以针对实验动物其他人畜共患病病原体设计特异性的探针，以期可以同时检测更多的病原体。

表3 液相芯片检测体系灵敏度结果Table 3 The sensitivity test results of liquichip technique