伊犁河谷新疆褐牛隐孢子虫感染情况调查

阿曼古丽·斯拉依，赵卫东，王进香，赵建国，黄 燕，韩先干，王 旭，龚海燕，米荣升，陈兆国

（1.中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室（上海）农业农村部动物寄生虫学重点实验室，上海200241；2.新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心，伊宁8350993；3.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，银川750011；4.海南大学生命科学与药学院 教育部热带生物资源重点实验室，海口 570228）

隐孢子虫（Cryptosporidium spp）是一种重要的人兽共患寄生性原虫，可以通过污染了卵囊的水或食物进行传播，能够引起人和动物腹泻。隐孢子虫在全世界范围内均有报道，各个年龄阶段均可感染，儿童和幼龄动物更易感，严重的可以造成死亡[1]。

传统的隐孢子虫检测方法是对粪便样品进行染色或饱和蔗糖漂浮，然后用显微镜进行镜检。但是，很多隐孢子虫形态学非常相似，仅利用常规的显微镜检技术无法鉴别虫种，而使用PCR扩增结合测序方法，能够鉴定感染的虫种或基因型[2]。当前，应用分子检测方法，已经鉴定的隐孢子虫虫种多达30多种。虽然并不是所有虫种均可以感染人[3]，但有必要对动物感染的隐孢子虫进行虫种鉴定，弄清感染的虫种或基因型，这对于制定有效的防控措施具有重要的意义。

伊犁河谷位于新疆西北部，河谷内北、东、南三面环山，自东向西敞开为“U”形谷地，属于温带大陆性气候，气候温和湿润，素有“天山湿岛”之称[4]。伊犁河谷区域包括伊犁州八县两市，具有得天独厚的草地畜牧业条件，天然草地面积占河谷土地总面积的60.9%，畜牧业是伊犁河谷最具优势的产业之一[5]。养牛业在伊犁河谷地区畜牧业经济中占有重要的位置，而新疆褐牛的养殖量占该地区牛养殖量的62.9%[6]；同时，伊犁河谷也是新疆褐牛最大的养殖基地，养殖量占全疆的60.0%[7]。

新疆褐牛是我国自主培育的耐粗饲、耐严寒、放牧性能优越的乳肉兼用品种，是新疆农牧区黄牛改良的主推品种，西北地区部分省市也有少量引进与繁育，具有西北第一牛的美称[7]。然而，关于新疆褐牛隐孢子虫的感染情况报道还非常少，2016年，仅见Qi等[8]对新疆5个地区少量样品的检测，其中包含伊犁河谷区域昭苏县72份成年褐牛样本的检测。因此，关于伊犁河谷区域新疆褐牛隐孢子虫的感染情况以及感染的隐孢子虫虫种或基因型，是否存在人兽共患虫种，对养殖业是否造成影响等问题，均有待研究。为了解伊犁河谷区域新疆褐牛隐孢子虫病分子流行情况，本研究对伊宁市和察布查尔锡伯自治县的4个褐牛养殖场进行粪便样品采集，进行隐孢子检测，以了解和掌握该地区新疆褐牛隐孢子虫的感染情况，以及感染的虫种或基因型，为制定有效的隐孢子虫防控方案提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 隐孢子虫DNA由中国农业科学院上海兽医研究所动物源性病原生物学与食品安全创新团队保存；基因组DNA提取试剂盒（FastDNA SPIN Kit for Soil）购自美国MP公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；pLB零背景快速克隆试剂盒购自天根生化（北京）有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、琼脂糖（Agarose）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA聚合酶（KOD FX）购自东洋纺生物科技有限公司；DL2000 DNA marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2 样品采集 选取伊犁河谷区域内伊宁市和察布查尔锡伯自治县的4个养殖场为采样点，分别于2018年12月（冬季）和2019年4月（春季）进行粪便样品采集。每个养殖场按断奶前犊牛、断奶后犊牛、育成牛和成年牛分类进行采集，每个年龄段至少采集10份。所有样品置于低温保存盒，带回实验室。

1.3 样品的前处理 样品加少量PBS溶解，吸管反复吹打冲洗，弃去棉签，吸粪水溶液于2 mL无菌离心管中，PBS反复洗2次后离心，弃上清液，沉淀用于DNA的提取。

1.4 样品DNA的提取 严格按照FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒操作说明提取样品DNA，用100 μL洗脱缓冲液收集样品DNA，-20℃保存，待检。

1.5 引物的合成 以隐孢子虫小亚基核糖体DNA（SSUrDNA）为目的基因，进行套式PCR扩增。PCR扩增的外引物序列为：5'-TTCTAGAGCTAATA CATGCG-3'（P1-1）和5'-CCCATTTCCTTCGAA ACAGGA-3'（P1-2）；内引物序列为：5'-GGAAG GGTTGTATTTATTAGATAAAG-3'（P2-1）和5'-CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA-3'（P2-2）[9-10]。引物送赛默飞世尔科技（中国）有限公司进行合成。

1.6 样品的PCR扩增 每份待检样品取2 μL，依据参考文献[11]进行PCR扩增SSUrDNA。取第二轮扩增产物5 μL在1.2%的琼脂凝胶上进行电泳，凝胶成像仪观察扩增结果。

1.7 阳性样品的分子鉴定 将经电泳鉴定正确的PCR胶回收产物用快速克隆试剂盒与载体进行连接与转化，挑取阳性菌落进行培养和PCR鉴定，将鉴定正确的阳性克隆送赛默飞世尔科技（中国）有限公司测序。将获得的序列进行Blast（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对，鉴定所感染的隐孢子虫虫种或基因型；同时，应用Lasergene 7.0软件对获得的序列进行同源性分析。

1.8 阳性样品的系统进化树构建 从GenBank上下载多种隐孢子虫的SSUrRNA基因序列作为参考序列，以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）的SSUrDNA基因序列（GenBank登录号：AF026388）作为外源序列。利用MEGA 7.0软件，与本试验获得的隐孢子虫序列一起构建系统进化树，进一步确认新疆褐牛感染的隐孢子虫的虫种或基因型。

1.9 数据的统计分析 应用统计分析软件SPSS V21.0，对不同养殖场、不同日龄和不同季节之间的感染情况进行卡方检验（χ2），比较不同条件下新疆褐牛的感染率是否存在差异。当P＞0.05时，判定为差异不显著，不具有统计学意义；当P＜0.05时，判定为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 伊犁河谷新疆褐牛总的感染情况 本研究以新疆褐牛为研究对象，从伊宁市和察布查尔锡伯自治县的4个养殖场采集356份粪便样品进行隐孢子虫检测。提取所有样品DNA，进行套式PCR扩增，成功扩增出12份阳性样品，PCR扩增的目的片段大小为830 bp，与预期一致（图1）。研究发现隐孢子虫总的感染率为3.37%（12/356），高于Qi等[8]（2016）对新疆部分地区褐牛隐孢子虫感染情况的报道（2.29%，10/436），也高于作者对伊犁河谷区域昭苏县褐牛所报道的感染率（2.78%，2/72）。应用统计学方法，将本试验获得的结果与Qi等[8]报道的结果进行统计学分析，发现两者差异并不显著（P＞0.05），说明本试验的结果与之前的报道基本一致。

图1 部分新疆褐牛样品PCR扩增结果Fig.1 The results of PCR amplification of partial samples collected from Xinjiang Brown cattle

虽然有关新疆褐牛感染隐孢子虫的报道非常少，但是目前我国其他品种的牛感染隐孢子虫的报道已经非常多，尤其是奶牛和牦牛。对我国30年来牛感染隐孢子虫情况的调查研究显示，我国牛隐孢子虫总的感染率为14.50%，其中奶牛感染率为13.98%，牦牛为20.92%，肉牛为10.47%，水牛为15.50%[12]。本研究发现新疆褐牛隐孢子虫感染率为3.37%，明显低于我国其他品种牛的感染水平，提示隐孢子虫的感染可能与牛的品种相关。

由于新疆褐牛隐孢子虫的检出率比较低，本研究取了部分阴性样品用饱和蔗糖漂浮后进行镜检验证，发现镜检结果与PCR扩增结果一致，均为阴性。同时，对12份阳性样品进行镜检，仅发现5份阳性样品，这可能与样品中隐孢子虫的含量较低有关，因为PCR检测方法与常规的显微镜检测相比敏感性更高。

2.2 不同地区新疆褐牛隐孢子虫感染情况 本次调查选取伊宁市和察布查尔锡伯自治县4个养殖场进行取样。其中，伊宁市2个养殖场共采集样品195份，感染率为4.10%（8/195），仅在养殖场1发现隐孢子虫阳性样品，阳性率为8.08%（8/99），养殖场3的阳性率为5.00%（4/80）；察布查尔锡伯自治县2个养殖场共采集样品161份，感染率为2.48%（4/161），仅在养殖场3发现隐孢子虫感染，阳性率为5.00%（4/80）（表1、2）。统计分析显示，两个地区之间感染率差异不显著（χ2=0.709，P＞0.05），但是不同养殖场之间感染率存在显著性差异（χ2=13.569，p＜0.05），而养殖场1/养殖场3与养殖场3/养殖场4之间均存在显著性差异（P＜0.05）。

表1 不同地区新疆褐牛隐孢子虫分子流行情况Table 1 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different regions in Xinjiang Brown cattle

表2 不同养殖场新疆褐牛隐孢子虫分子流行情况Table 2 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different farms in Xinjiang Brown cattle

2.3 不同日龄新疆褐牛隐孢子虫的感染情况 本次调查中每个养殖场按断奶前犊牛、断奶后犊牛、育成牛和成年牛4个年龄段进行取样。检测结果表明，成年牛的感染率最高（5.59%，9/161），其次是育成牛（3.45%，2/58）和断奶后犊牛（1.12%，1/89），而断奶前犊牛并未检出隐孢子虫感染，但不同日龄间感染率差异并不显著（χ2=5.490，p＞0.05）（表3）。有研究表明，犊牛对隐孢子虫更易感，随着牛的日龄增大，隐孢子虫的感染率会逐渐下降[13]。然而，本研究结果与之前关于其他品种牛的报道不一致，这可能是由于冬季和春季为产犊淡季，导致本次调查中造成断奶前犊牛采样数量偏少，因此需要进一步采集更多数量的断奶前犊牛样品对本次调查结果进行验证。

表3 不同日龄新疆褐牛隐孢子虫分子流行情况Table 3 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different age groups in Xinjiang Brown cattle

2.4 不同季节新疆褐牛隐孢子虫感染情况 本次调查分别在冬季和春季对新疆褐牛进行了采样。结果显示，冬季的感染率为5.68%（10/176），春季的感染率为1.11%（2/180），呈显著性差异（χ2=5.708，p＜0.05）（表4），该结果不同于其他品种牛的报道。2013年，Mi等[14]对青海地区牦牛感染隐孢子虫的调查发现，春天的感染率最高（28.35%）；2011年，Wang等[15]对河南断奶前奶牛的调查发现，夏季的感染率最高（50.00%）。由于本试验只在冬季和春季进行了取样，因此，还不能确定是否冬季感染率最高，需要进一步对夏季和秋季进行取样检测加以验证。

表4 不同季节新疆褐牛隐孢子虫分子流行情况Table 4 Prevalence and distribution of Cryptosporidium spp. in different seasons in Xinjiang Brown cattle

2.5 新疆褐牛阳性样品的序列分析结果 将12份阳性样品进行切胶回收、连接、转化和测序，将获得的阳性克隆序列进行Blast比对以鉴定虫种或基因型，同时利用Lasergene 7.0软件进行同源性分析。结果发现，伊犁河谷新疆褐牛存在2种隐孢子虫感染，为安氏隐孢子虫（C. andersoni）和瑞氏隐孢子虫（C. ryanae），其中91.67%（11/12）是C. andersoni感染，仅发现1份C. ryanae感染（表1）。其中，10个C. andersoni阳性样品（CB-8、CB-36、YN-1、YN-2、YN-3、YN-10、YN-11、YN-25、YN-26、YN-62）与KF271456同源性为100%，1个C.andersoni阳性样品（CB-25）与KF826311同源性为100%，1个C. ryanae阳性样品（CB-26）与KT922233同源性为100%（图2）。应用MEGA 7.0软件对本研究获得的12条SSUrDNA序列及GenBank上下载的不同种隐孢子虫序列进行系统进化树构建，发现与Blast比对的结果一致，所有阳性样品均与相对应的C. andersoni和C. ryanae序列在同一个分支上（图3）。

图3 隐孢子虫的 SSUrDNA基因系统进化树构建Fig. 3 Phylogenetic tree of SSUrDNA sequences of Cryptosporidium spp.

图2 本研究获得的隐孢子虫序列同源性比较Fig. 2 Homology comparison of different sequences of positive samples from Xinjiang Brown cattle

从不同地区、不同日龄和不同季节来看，新疆褐牛感染的虫种均存在差异。其中，伊宁市仅发现C. andersoni感染，察布查尔锡伯自治县发现C. andersoni和C. ryanae感染，但是C. andersoni是优势种（75.00%，3/4）（表1、2）；断奶后犊牛和育成牛中仅发现C. andersoni感染，而成年牛则发现C. andersoni和C. ryanae感染，但C. andersoni是优势种（88.89%，8/9）（表3）；春季仅发现C. andersoni感染，而冬季则发现C. andersoni和C. ryanae感染（表4）。

对我国牛感染隐孢子虫的虫种进行总结发现，我国奶牛和肉牛中感染率最高的虫种是C. andersoni，牦牛中感染率最高的是C. bovis，水牛中感染率最高的是C. ryanae[12-13]。本研究发现C. andersoni为褐牛感染的优势虫种，占阳性样品的91.67%。新疆褐牛属于肉牛的一个品种，本研究检测结果与之前的报道一致[12-13]。与本研究不同的是，2016年，Qi等[8]对新疆褐牛成年牛进行虫种鉴定，仅发现C. andersoni感染。然而，2015年，Qi等[16]对新疆地区奶牛隐孢子虫的检测发现4种隐孢子虫，包括牛隐孢子虫（C. bovis）、微小隐孢子虫（C. parvum）、瑞氏隐孢子虫（C. ryanae）和安氏隐孢子虫（C. andersoni），其中C. parvum在断奶前犊牛中感染率最高（59.5%），而C. andersoni在成年牛中感染率最高（51.1%）。这些结果的差异可能与牛的品种、采样地区的不同有关。

人和动物主要通过粪口途径感染隐孢子虫，尤其是污染了卵囊的食物和水进行传播，其中以介水传播最为严重，容易引起大规模的暴发流行[17]。伊犁河谷区域有新疆径流量最丰富的伊犁河，是农业和畜牧业的主要用水来源。2009年，孟静等[18]在伊宁市采集伊犁河水样20 L，样品经过滤浓缩以后，应用饱和蔗糖漂浮法和免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation，IMS）进行检测，隐孢子虫均为阳性。随后，作者用PCR-RFLP（限制性片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism）技术进行虫种鉴定，样品经SspI和VspI酶切后电泳分析，初步鉴定为小鼠隐孢子虫，但是并未对样品进行测序[19]。然而，利用生物信息学方法对本研究获得的C. andersoni序列进行SspI和VspI酶切分析，发现产物片段大小（SspI：448 bp、397 bp；VspI：730 bp、115 bp）与文献[19]报道的电泳条带大小相似，推测该伊犁河水感染的隐孢子虫应为C. andersoni，这与本研究在养殖场检测的虫种相同。我国其他地方也有关于水中检出C. andersoni的报道。2011年，Feng等[20]对上海水源隐孢子虫检测，发现C. andersoni的检出率高达82.35%（14/17）；2019年，Ma等[21]对西宁水源隐孢子虫的检测，也发现C. andersoni阳性样品。因此，新疆褐牛感染的隐孢子虫可能来源于水源污染，但这需要对牧场及其周围的水进行进一步检测才能确认。

综上所述，本研究从不同地区、不同日龄和不同季节角度，首次系统地调查了伊犁河谷地区新疆褐牛隐孢子虫的感染情况。研究发现，采自伊犁河谷区域4个新疆褐牛养殖场的样品，2个养殖场样品中发现隐孢子虫感染，总感染率为3.37%，该结果显著低于我国其他品种牛隐孢子虫的平均感染水平。本调查结果中，成年褐牛的感染率最高，但是与其他日龄之间差异不显著；而冬季的感染率则显著高于春季。分子鉴定结果表明，该地区新疆褐牛存在C. andersoni和C. ryanae两种隐孢子虫感染，其中C. andersoni是优势种（91.67%）。虽然C. andersoni有感染人的报道[22-24]，目前并不是感染人的优势种，但仍需引起注意，尤其是牧区的牧民。本研究结果为深入了解伊犁河谷区域新疆褐牛隐孢子虫的流行情况和制定有效的防控措施提供数据支持。