鸡白痢沙门菌的分离鉴定与耐药性分析

陈丹清，王 建

（江苏省常州市武进区动物疫病预防控制中心，常州 213161）

鸡白痢沙门菌（SalmonellaPullorum）为肠杆菌科沙门菌属成员，是一类在鸡场中较为常见的重要病原菌[1-2]，可引起雏鸡的下痢、急性败血症等，死亡率较高，成年鸡则主要呈现慢性感染或隐性感染，可长期带毒且可经卵垂直传播，给养鸡户带来了巨大的经济损失[3-5]。目前使用抗生素进行治疗仍是防治鸡白痢的重要措施之一，但由于抗生素的长期甚至是不合理使用，使得沙门菌产生了广泛而严重的耐药[6-9]，因此，加强鸡场中病原菌的耐药性监测对于细菌病的防治至关重要。

本研究采集某鸡场疑似感染鸡白痢的病死鸡组织，进行沙门菌的分离、鉴定及药物敏感性试验，根据药敏试验结果，为该鸡场合理用药提供指导，也为该地区鸡白痢的综合防控及耐药性监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 选取某鸡场临床症状与病理变化疑似鸡白痢的病死鸡32只，采集肝脏与心脏等组织作为待检病料。

1.2 试剂 麦康凯琼脂、LB培养基、革兰氏染色试剂盒等购自青岛海博生物技术有限公司；细菌微量生化反应管（葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇、吲哚、硫化氢、枸橼酸盐）及药敏纸片（阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星、链霉素、头孢噻肟、头孢唑林、强力霉素、四环素）购自杭州天和微生物试剂有限公司；DL2000 DNA marker、2×TaqPCR Master Mix购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 细菌的分离培养 无菌采集病死鸡的肝脏、心脏等组织样品接种于麦康凯琼脂平板上，37℃培养18～24 h，选取单个可疑菌落按常规方法于平板上反复划线，挑取典型单克隆菌落置于LB培养基中进行增菌培养，用于后续鉴定。

1.4 分离菌株的染色镜检 挑取单克隆菌落制成涂片，按照革兰氏染色试剂盒说明书进行染色、镜检，观察菌株形态。

1.5 分离株的生化试验 按照细菌微量生化反应管说明书，将单克隆菌株分别接种至各生化管中，经37℃培养24～48 h观察结果。

1.6 鸡白痢沙门菌的PCR鉴定 根据参考文献[10]，合成鸡白痢沙门菌的血清型特异性PCR检测引物。F：5'-CGATAATGGCAACCGCACTG-3'，R：5'-TGATGTCTGCCCCTTTCGAC-3'，扩增产物大小为356 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

取200 μL待检菌液采用煮沸裂解法提取基因组DNA，以此为模板进行PCR鉴定，同时以灭菌ddH2O为阴性对照。PCR反应体系（25 μL）：DNA模板1 μL，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，加ddH2O补足至25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸7 min。根据1%的琼脂糖凝胶电泳结果，判定分离菌株血清型。

1.7 分离菌株的药敏试验 以大肠埃希氏菌ATCC25922为药敏质控菌株，采用K-B纸片扩散法进行分离菌株的药敏试验[11]。将分离菌株24 h培养菌液用无菌生理盐水配置成0.5麦氏单位，均匀涂布于LB琼脂平板上，贴上药敏纸片置于37℃培养18～24 h，测量抑菌圈直径，判定分离菌株对10种常用抗生素的耐药情况[12]。

2 结果与讨论

2.1 菌株的初步分离与镜检 病死鸡组织中分离的可疑菌株在麦康凯琼脂平板上形成圆形、光滑、白色或无色的细小菌落，将菌落反复纯化培养，共获得27株可疑菌株培养物，经革兰氏染色镜检均为短小、两头钝圆的革兰氏阴性杆菌，多为分散存在，符合沙门菌的菌落特征。

2.2 生化试验 将27株纯培养的可疑菌株接种至微量生化反应管中，37℃培养24～48 h后，分离株的生化试验结果一致（表1），均能发酵葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、卫矛醇，不发酵乳糖、蔗糖、麦芽糖，不产生吲哚、硫化氢，不利用枸橼酸盐，符合鸡白痢沙门菌的生化特性。

表1 分离菌株的生化特性Table 1 Biochemical characteristics of isolates

2.3 菌株血清型的PCR鉴定 用鸡白痢沙门菌特异性引物进行PCR检测，27株可疑菌株均可扩增出356 bp的目的条带（图1），证明分离所得的菌株均为鸡白痢沙门菌。

图1 部分分离菌株PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification results of partial isolates

2.4 药敏试验 对27株鸡白痢沙门菌分离株进行了10种常用抗生素的敏感性试验，结果见表2。分离株除了对阿米卡星和庆大霉素的敏感率达100%以外，对于其他8种药物均有不同程度的耐药情况，耐药率由高到低分别为：链霉素（88.89%）、四环素（62.96%）、阿莫西林（51.85%）、强力霉素（37.04%）、头孢唑林（29.63%）、恩诺沙星（14.81%）、环丙沙星（7.41%）、头孢噻肟（3.70%）。

表2 鸡白痢沙门氏菌分离株的药敏试验结果Table 2 The antimicrobial resistance of Salmonella pullorum isolates

沙门菌分离株的多重耐药情况也十分严重，所有分离菌株至少可耐1种药物，70.37%（19/27）的菌株可耐3种以上药物，其中3耐菌株数量最多，达48.15%（13/27），而7.41%（2/27）的菌株最多可耐5种药物（图2）。这严重的多重耐药大大增加了疾病防治的难度。

图2 鸡白痢沙门菌分离株的多重耐药情况Fig.2 Multi-drug resistance of Salmonella Pullorum isolates

根据本研究的药敏试验结果，建议该鸡场选取阿米卡星、庆大霉素、头孢噻肟等高敏药物进行鸡白痢的防治工作，并在治疗过程中采用交叉用药、轮换用药等方式，以达到较好的疗效，降低耐药菌株产生的可能性[13]。同时，加强鸡场的饲养管理水平，建立生物安全体系，定期对环境及器械等进行消毒，消除致病菌的增殖与传播，保证鸡群的健康。