电针干预后透镜诱导型近视豚鼠巩膜形态改变及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和脯氨酰羟化酶2(PHD-2)表达的变化△

於亭 宋继科 魏慧霞 田庆梅 纪海峰 毕宏生 解孝锋

近视是导致视力障碍的主要原因，并且正成为世界范围内主要的公共卫生问题。Holden等[1]预测，到2050年，将有47.58亿近视患者(占世界人口的49.8%)和9.38亿高度近视患者(占世界人口的9.8%)。近视的发展与眼轴的过度延长相关，这种变化往往伴随着巩膜变薄[2]。巩膜为眼球提供框架，以维持眼球的形状和完整性，在改变眼球大小和屈光状态方面起着重要作用。近年来研究发现[3-4]，在近视发展过程中，巩膜中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达上升，造成巩膜缺氧。因此，改善巩膜缺氧将成为控制近视发展的一种有效治疗方法。而电针作为中国传统医学具有改善组织血氧微环境及上调HIF-1α表达作用[5]，并且在治疗近视方面已取得了一些临床疗效[6-7]。本研究旨在探讨电针干预后透镜诱导型近视(LIM)豚鼠巩膜超微结构变化及巩膜中HIF-1α和脯氨酰羟化酶2(PHD-2)表达变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物选取2周龄雄性健康英国种三色短毛豚90只(购自济南西岭角生物科技有限公司)，体质量100～120 g。实验动物入组前均排除白内障、角膜病变、近视等眼病。饲养条件：室温22～25 ℃，予以12 h/12 h的昼夜节律，环境光照强度300 lux。实验期间所有豚鼠自由摄食、进水，并给予富含维生素的饲料及新鲜蔬菜等以补充维生素C。实验中严格遵守视觉与眼科动物研究协会(the Statement of Animals Research in Vision and Ophthalmic，ARVO)原则。

1.1.2 主要试剂及仪器10 g·L-1盐酸环喷托酯滴眼液(美国爱尔康公司)，4 g·L-1盐酸奥布卡因(日本参天制药株式会社)，体积分数2.5%戊二醛溶液(国美集团化学试剂有限公司)；组织/细胞 RNA 快速提取试剂盒、反转录试剂盒(含基因组去除剂)、化学修饰热启动实时荧光定量PCR试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(山东思科捷科学仪器有限公司)；HIF-1α试剂盒(武汉基因美生物科技有限公司)；PHD-2试剂盒(泉州市睿信生物科技有限公司)；带状光检影镜(苏州六六视觉科技股份有限公司，YZ24)；眼科A超(法国Quantel Medical公司)；针灸针、电子诊疗仪[医疗用品厂有限公司(苏州)，华佗牌SDZ-V型]。

1.2 方法

1.2.1 动物造模及分组90只豚鼠随机均分为3组，每组30只，即正常对照(NC)组、透镜诱导型近视(LIM)组、电针+透镜诱导型近视(LIM+EA)组。NC组豚鼠正常饲养，不干预；LIM组和LIM+EA组豚鼠右眼配戴-6.0 D透镜片，建立近视模型；LIM+EA组豚鼠戴镜同时给予双侧针刺合谷穴和太阳穴，每天上午9点开始电针干预30 min。各组豚鼠每天早晚巡视2遍，及时发现脱落及脏的镜片，清洗干净后立即戴上，左眼作为自身对照不干预。电针参数：波形为连续波，频率2 Hz，强度2 mA，脉冲长度0.1 s。

1.2.2 各组豚鼠屈光度及眼轴长度的测量各组豚鼠造模后2 周、4 周采用带状光检影进行屈光度检查。检查前结膜囊内滴10 g·L-1盐酸环喷托酯散瞳液3次，每次1滴，间隔10 min，滴眼30 min后由验光师在暗室中使用带状光检影，工作距离为50 cm。屈光度为垂直和水平两条主子午线检验的平均值。

造模后2 周、4 周各组豚鼠采用A超进行眼轴长度测量，检查前用4 g·L-1盐酸奥布卡因眼液滴眼进行表面麻醉。仪器参数设置为[8]：前房传播速度1557 m·s-1，玻璃体传播速度1540 m·s-1，晶状体传播速度1723 m·s-1。测量时探头垂直角膜平面，且尽可能对准瞳孔中心，不压迫角膜，取图形较稳定、清晰且晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线为确定图像，每眼重复测量10次,取平均值。整个过程均由同一技师操作完成。

1.2.3 各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2的mRNA表达水平的检测造模后2周和4周每组随机选取6只豚鼠，麻醉致死后取出右眼眼球，沿角巩膜缘剪开，去除角膜、虹膜、晶状体等眼前节组织，剥离出玻璃体，去除视网膜及脉络膜，获取后极部巩膜组织。用组织/细胞 RNA 快速提取试剂盒提取组织总RNA，逆转录为cDNA，采用q-PCR技术检测各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2 的mRNA相对表达水平，以GAPDH为内参基因。利用 DNAStar软件设计各引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成。HIF-1α上游引物:5’-AGCACAACTACAGCATTCCAGCAG-3’,下游引物：5’-GGTGGTGATGTTGTGGCACGAG-3’，大小为200 bp；PHD-2上游引物:5’-CTTGCGGGAGGGTTTTGGTGGTC-3’，下游引物：5’-CCCTCCCCTTCTGCCTCTTGGTTC-3’，大小为219 bp；GAPDH 上游引物:5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGA-AACC-3’，下游引物:5 ’-ATGCCAGCCCCAGCGTCA-AAAGT-3’，大小为170 bp。采 用 2-△△Ct方法对结果进行分析，将NC组目的基因的相对表达量设置为1。

1.2.4 各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表达水平的检测造模后2周和4周，每组取6只豚鼠右眼巩膜组织，液氮研磨，按质量体积比(20 mg200 μL)加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的放射免疫沉淀法缓冲液裂解液(RIPA)，充分匀浆直至裂解完全，14 000 r·min-1离心4 min，取上清，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。按照酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒说明书检测各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表达水平。

1.2.5 电镜观察各组豚鼠巩膜胶原纤维直径大小各组于造模后4周每组随机选取3只豚鼠，按8 mL·kg-1体质量腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥钠，过量麻醉处死后摘取右眼眼球立即置于体积分数2.5%戊二醛溶液中固定。2 h后取出眼球，将后极部眼球壁切成<1 mm条状大小置于体积分数2.5%戊二醛溶液中固定，体积分数1%锇酸行后固定，各级酒精及丙酮脱水，浸透包埋，固化，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，透射电镜观察。由同一技师使用Image J软件对各组豚鼠巩膜胶原纤维直径进行测量。

1.3 统计学方法采用 SPSS 21.0 统计学软件进行分析。造模后各组豚鼠间屈光度、眼轴长度、巩膜胶原纤维直径及HIF-1α和PHD-2的mRNA及蛋白表达水平比较采用多重比较LSD-t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 各组豚鼠屈光度、A超测量参数比较造模前，NC组、LIM组和LIM+LA组豚鼠右眼屈光度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。造模后2周和4周，与NC组豚鼠右眼屈光度相比，LIM组和LIM+EA组豚鼠右眼近视屈光度均明显增加(均为P<0.001)。与LIM组相比，LIM+EA组豚鼠右眼近视屈光度均减小(P2周<0.01、P4周<0.001)(见表1)。

造模后2周和4周，与NC组相比，LIM组和LIM+EA组晶状体厚度均增加，除LIM+EA组造模后2周晶状体厚度差异无统计学意义外，其他时间点差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后2周和4周，与NC组相比，LIM组和LIM+EA组玻璃体腔深度增加(均为P<0.01)；LIM组和LIM+EA组眼轴均延长(均为P<0.001)。与LIM组相比，LIM+EA组前房深度、晶状体厚度和玻璃体腔深度均下降，但差异均无统计学意义(均为P>0.05)，眼轴长度变短(P<0.05)。造模前及造模后2周、4周，三组豚鼠前房深度比较，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表2)。

表1 造模前及造模后2周和4周3组豚鼠屈光度

表2 造模前及造模后2周和4周3组豚鼠A超测量参数比较

2.2 各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2的mRNA表达水平的比较造模后2周和4周，LIM组豚鼠右眼巩膜中HIF-1α mRNA表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显升高(均为P<0.05)，而NC组豚鼠右眼巩膜中HIF-1α mRNA表达水平与LIM+EA组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表3)。

造模后2周和4周，LIM组豚鼠右眼巩膜中PHD-2 mRNA表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显降低(均为P<0.05)，而NC组豚鼠右眼巩膜中PHD-2 mRNA表达水平与LIM+EA组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表3)。

2.3 各组豚鼠巩膜中HIF-1α和PHD-2的蛋白表达水平的比较造模后2周和4周，LIM组豚鼠右眼巩膜中HIF-1α蛋白表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显升高(均为P<0.05)，而NC组右眼巩膜中HIF-1α蛋白表达水平与LIM+EA组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)。造模后2周和4周，LIM组右眼巩膜中PHD-2蛋白表达水平与NC组和LIM+EA组相比均明显降低(均为P<0.05)，而NC组豚鼠右眼巩膜中PHD-2蛋白表达水平与LIM+EA组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表3)。

2.4 各组豚鼠巩膜电镜观察结果造模后4周，各组豚鼠巩膜电镜下观察发现，随着屈光度的增加，巩膜胶原纤维越稀疏、直径越小。与NC组豚鼠巩膜胶原纤维直径[(82.94±26.03)nm]相比，LIM组[(48.90±23.38)nm]和LIM+EA组[(62.83±21.72)nm]豚鼠巩膜胶原纤维直径均变小(均为P<0.001)。与LIM组相比，LIM+EA组胶原纤维直径变大(P<0.001)(见图1)。

表3 造模后2周和4周各组豚鼠巩膜HIF-1α和PHD-2的mRNA和蛋白表达水平的比较

图1 造模后4周各组豚鼠巩膜电镜观察结果

3 讨论

由于豚鼠的屈光状态、正视化机制与人类相似，常用于制作近视模型，并且豚鼠LIM模型已广泛应用于近视的实验研究。目前，对于近视发病机制的研究主要认为是通过视网膜-视网膜色素上皮层-脉络膜信号转导系统启动作用到巩膜重塑的信号，导致巩膜细胞外基质重塑，巩膜进行性变薄，眼轴长度变长，最终导致近视的发展[2，9]。豚鼠等哺乳动物的巩膜主要由胶原纤维、成纤维细胞和细胞外基质构成。本研究发现，在近视发展过程中，LIM组豚鼠巩膜胶原纤维直径变小，与以往研究结果一致[10]；并且，在电针干预后，LIM+LA组豚鼠巩膜胶原纤维直径较LIM组变大。表明电针可以改善巩膜胶原纤维降解影响近视的发生发展。

近年来研究表明，在近视发展过程中[3-4],HIF-α表达升高导致巩膜缺氧，参与近视的发生发展。而在玻璃体内注射抗缺氧药物后可以上调HIF-1α表达，进而有效改善巩膜缺氧，抑制近视的发生发展[3]，表明改善巩膜缺氧是延缓近视的有效治疗方法。HIF-1α在常氧状态下经PHD羟化后，泛素-蛋白酶体系统迅速降解；而在缺氧状态下,PHD活性下降，HIF-1α降解减少导致其大量积聚，从而诱导机体缺氧反应[11]。PHD作为氧感受器，是降解HIF-α的关键酶。PHDs分为PHD-1、PHD-2和PHD-3，其中PHD-2活性强度最高[12]。本研究中也发现，在近视发展过程中，随着HIF-1α表达水平升高，PHD-2含量下降，造成巩膜缺氧。

目前对于近视的治疗手段多样，但仍缺乏治疗效果可靠、副作用小的治疗手段。而近年来，针灸作为祖国传统医学用于治疗近视取得了一定的成效，已证实可以改善近视的发生发展[9，13-15]。袁野[16]研究发现，通过眼三针配合耳穴及眼眶外经穴配合耳穴治疗青少年近视，可改善患者视物干涩、酸胀等不适症状及延缓近视的发展。王晶等[17]研究发现，通过对轻中度近视青少年给予电针加体针治疗，近视显著改善，而眼轴长度没有明显影响[18]。但是吴姗姗等[15]在透镜诱导型近视豚鼠中发现，电针不仅改善了近视，也延缓了眼轴的发展。表明电针在治疗近视方面确实发挥着一定的作用，但是其具体机制并不明确。电针作为中国传统医学，可使眼周血管平滑肌紧张度降低，血管痉挛解除，管腔通畅，血流速度加快，改善局部神经、肌肉的血液供应，消除缺血和缺氧状态[14]，有研究也证明电针干预可以上调HIF-1α表达[5]。因此，我们猜测电针干预可通过改善眼部血液微循环以改善巩膜缺氧，进而延缓近视发生发展。本研究结果也证实了，电针干预可以通过上调PHD-2含量来抑制HIF-1α表达，从而改善巩膜缺氧以延缓近视发生发展，然而，电针干预改善巩膜缺氧的具体信号分子及其具体机制尚未完全明确，仍需进一步探索其可能的分子机制，为研究近视发生发展过程中巩膜的作用提供有效的分子生物学基础。