沙门氏菌检测生物传感器研究进展

吴有雪，吴美娇，田亚晨，王 政，郭 亮，刘 程，方水琴，刘 箐

（上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）

沙门氏菌（Salmonella）感染是人们持续关注的公共卫生安全问题，据我国2015年食源性疾病监测数据显示，沙门氏菌造成的食源性疾病占食源性疾病爆发总数的11.66%，是造成食源性疾病的第三大致病菌[1]。另外，2015年澳大利亚和2017年欧盟的食源性疾病监测数据显示[2]，由沙门氏菌引发的食源性疾病分别占食源性疾病爆发总数的63.03%、22.12%，是最主要的食源性致病菌。沙门氏菌正不断威胁人们的生命健康，因此，对于食品中沙门氏菌的检测十分重要。

沙门氏菌是一种革兰氏阴性杆菌，有2 650多种血清型[3]。鼠伤寒型、甲型副伤寒型沙门氏菌易导致肠热病，其中，鼠伤寒血清型沙门氏菌是最主要的造成全身感染的沙门氏菌[4]。传统的沙门氏菌检测方法包括分离培养和生化鉴定、免疫分析法、核酸分析法等，由于其灵敏度低、操作繁琐、耗时耗力而逐渐被取代，各种新型的检测方法不断发展。生物传感器是将生物信号与物理或化学换能器结合并转化为可以监测信号的一类装置[5]，由于生物传感器在沙门氏菌检测中表现出优良的性能，逐渐得到了广泛的应用。在各种类型的传感器中，基于纳米材料的生物传感器是目前性能最好的生物传感器[6]。这是由于纳米材料独特的结构可表现出力学、热学、磁学、光学以及电学等不同方面的性质，将纳米粒子的性质应用于生物信号的传导以及生物信号的固化，有利于提高检测的灵敏性，增强检测的实时性及简便性。使用生物传感器检测沙门氏菌操作更为简便、检测时间更短，有利于实现沙门氏菌的现场实时检测。本文就沙门氏菌传统检测技术和检测中各类生物传感器进行了详尽分析，并对沙门氏菌生物传感器的应用进展进行了阐述，为沙门氏菌检测技术的发展提供研究基础和技术支持。

1 沙门氏菌传统检测技术

沙门氏菌传统检测技术主要包括常规培养法、核酸分析法、免疫学检测法等。常规培养法主要依据各种行业标准和国家标准，这些标准的检测方法可靠性高，但存在一些局限性。由于表面抗原的改变或丢失，同种血清型沙门氏菌的抗原性可能不同，致使血清学检测方法的敏感性较低，容易产生假阴性[7-8]。此外，肠杆菌科之间生化反应多有交叉，可能会出现假阳性[9-10]。核酸分析法是对沙门氏菌特异性的核酸序列进行扩增或者识别的一种技术[11]。沙门氏菌含有特异性的保守序列侵袭蛋白A（invasion protein A，invA）基因[12]，以此片段设计引物和探针进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）鉴定是实验室中常用的沙门氏菌检测方法。目前所用的核酸分析法特异性高、准确性高，但需要专业的仪器设备和工作人员良好的操作水平，对于大规模爆发的沙门氏菌感染事件无法达到快速检测的要求。免疫学检测法依赖于抗原抗体的特异性结合，将生物信号放大为可以监测的化学信号，以达到检测细菌的目的[13]。与常规培养法相比，免疫学检测法特异性强、灵敏度高，是病原菌检测中常用的方法。然而，这些方法在沙门氏菌检测方面有一些潜在的缺点，包括耗时长、存在交叉反应等。

2 生物传感器

生物传感器是一类能感应生物反应并将生物反应经过信号放大转化为可以检测到的光、电等化学信号的装置，其构造主要包括识别元件（抗原、抗体、酶、核酸、微生物、细胞、组织等）、信号转导元件、信号放大元件（图1[14]）。生物传感器检测沙门氏菌是以抗原抗体的特异性识别、核酸或适配体对菌体的特异性识别为基础，将生物信号放大并转化为光学或者电化学信号，通过建立化学信号与沙门氏菌浓度之间的关系达到检测的目的[15]。

图1 生物传感器基本组件图[14]Fig.1 Basic components of biosensors[14]

2.1 光学沙门氏菌检测生物传感器

光学生物传感器借助光吸收、荧光、聚集诱导发光、散射等光学现象实现生物信号的可监测化。基于光学原理的沙门氏菌检测是利用光学材料对抗原、抗体或适配体进行修饰，然后通过抗原与抗体之间或者适配体与菌体之间的特异性结合，以材料光学特性的变化反映细菌浓度的变化，实现对沙门氏菌的检测。表1总结了不同光学生物传感器在沙门氏菌检测中的应用，与传统的检测方法相比，各种生物传感器检测方法的灵敏度更高、检测时间更短、检测成本更低且不需要大型的仪器设备。除荧光标记形式的生物传感器外，大多数生物传感器都无需标记，操作更为简便。其中，表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器定量检测范围更广、检测时间更短，符合现场实时检测的要求，具有很高的研究价值和广泛的应用前景。

表1 不同光学生物传感器在沙门氏菌检测中的应用Table 1 Application of different optical biosensors in Salmonella detection

2.1.1 比色法生物传感器

比色分析法是基于溶液对光的选择性吸收而产生的可视化颜色或依靠光谱学仪器检测光学变化的一类分析方法。利用比色分析法独特的光学特性可以实现沙门氏菌的快速检测，同时，纳米颗粒、适配体等的引入在沙门氏菌检测中发挥了重要的作用，提高了灵敏度，实现了检测的可视化。

以抗原抗体特异性结合的免疫学检测法与生物传感器相结合，实现了沙门氏菌检测的高灵敏度和高特异性。Wang Lei等[16]利用沙门氏菌抗体修饰的磁性颗粒形成磁栅分离柱来特异性捕获沙门氏菌，抗体修饰的Pt@ZIF-8纳米催化剂能够催化3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）显色。该比色生物传感器达到了低至11 CFU/mL的沙门氏菌检测限，灵敏度高。此外，适配体与探针在沙门氏菌传感器中的应用也实现了高灵敏度及快速检测的目的。Ma Xiaoyuan等[29]利用4-巯基苯甲酸和硫酸化的鼠伤寒沙门氏菌适配体对刺状金纳米粒子进行功能化修饰，并以此作为表面增强拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）的纳米探针，利用适配体特异性捕获沙门氏菌，建立夹心式的适配体生物传感器检测平台。根据1 586 cm-1处SERS强度的线性关系实现沙门氏菌的定量检测，线性检测范围为10～105CFU/mL，其检测限达到4 CFU/mL。除抗体、适配体外，DNAzyme探针也可作为识别元件对沙门氏菌进行检测。Luo Rong等[20]建立了基于DNAzyme探针自组装金纳米粒子的比色传感器方法（图2[20]），在靶序列存在的情况下，靶序列与捕获探针结合，进一步与金纳米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）上修饰的检测探针结合，形成夹心式结构。修饰在AuNPs上的DNAzyme探针与血红素形成G-四链体-血红素复合物，该复合物可催化H2O2与TMB的反应，发生颜色的变化，从而实现对沙门氏菌invA基因的检测，其检测限可达到3×103CFU/mL。该方法肉眼可见地实现了基因片段的鉴定，具有省时、简便的特点。

2.1.2 SPR生物传感器

SPR是光入射到金属膜-液体界面上，金属介质表面由于自由电子共振增强了对入射光的吸收，从而导致折射率改变的一种光学现象。SPR生物传感器是基于SPR光学特性的检测仪器，通过分析物与固定在SPR传感器上的生物识别分子相结合的方式导致折射率变化，由生物分子的含量与折射率的线性关系反映样品中沙门氏菌的浓度。Mazumdar等[30]利用SPR传感器表面的金属片连接沙门氏菌抗体，通过捕获抗体与沙门氏菌结合引起SPR角度的变化检测沙门氏菌，检测限为1.25×105cell/mL。

为了更好地提高SPR生物传感器的灵敏性，研究人员将金属片与纳米粒子相结合以增加折射率的变化，在沙门氏菌检测中得到广泛的应用。Liu Xia等[31]将磁性纳米粒子修饰的抗体连接Au片，将其固定在SPR传感器的表面以捕获沙门氏菌，沙门氏菌与抗体结合后导致折射率发生改变。此传感器对于肠炎沙门氏菌的检测限低至14 CFU/mL，并在14～1.4×109CFU/mL内呈现良好的线性关系，该方法灵敏度高、检测范围广，是一种很好的检测肠炎沙门氏菌的方法。Lan Yubin等[32]也利用Au包裹的SPR传感器特异性捕获鼠伤寒沙门氏菌，检测鸡肉中沙门氏菌的含量，检测限为106CFU/mL。同时，等离子聚合物的发现也提高了沙门氏菌快速检测的速率，有效缩短了检测时间。Makhneva等[33]利用戊二醛激活沉积在SPR传感器表面的等离子体聚合物，以连接抗体，形成抗体的固定化平台。通过抗原抗体结合引起的折射率变化反映沙门氏菌的浓度，其检测限为105CFU/mL，检测时间缩短至10 min。此方法检测时间很短，但与上述基于纳米粒子的SPR生物传感器相比，检测限差了4 个数量级，有待进一步的改善。

2.1.3 荧光生物传感器

一些物质经过紫外光的照射后，其含有的各原子被激发，处于激发态的原子间发生原子能级的跃迁，从而反射出各种可见光，使物质呈现荧光现象。基于荧光的发生原理，利用物质之间的相互作用产生的荧光增强、荧光猝灭、催化荧光等现象，已被广泛应用于微生物的鉴定。基于荧光现象的生物传感器实现了沙门氏菌快速灵敏的检测，且大大缩短了检测时间。

图2 DNAzyme探针自组装的金纳米粒子作为单标记物的沙门氏菌比色传感器[20]Fig.2 DNAzyme probe self-assembled gold nanoparticles used as a single label in colorimetric sensor for Salmonella detection[20]

Xiong Ying等[34]利用histone-ds-poly（AT）模板化的铜纳米粒子的荧光信号作为信号转导子，AT模板化的铜纳米粒子连接捕获抗体，实现对霍乱沙门氏菌的捕获，沙门氏菌进一步结合氧化葡萄糖氧化酶标记的检测抗体。氧化葡萄糖氧化酶可控制荧光物质的合成，由荧光信号的变化即可得出霍乱沙门氏菌浓度的变化，此荧光免疫生物传感器对霍乱沙门氏菌具有极好的敏感性，检出限为8.8×104CFU/mL，比基于TMB的传统免疫分析法低3 个数量级。但此方法需要对检测抗体进行标记，操作步骤繁琐且每次标记的质量存在误差。此外，一些无需标记的检测方法也被用于沙门氏菌的检测，Srinivasan等[26]建立了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的无标记适配体荧光传感器的方法（图3[26]），当适配体和AuNPs与罗丹明（rhodamine，RB）共混时，RB通过荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）发生明显猝灭，鼠伤寒沙门氏菌加入后与适配体特异性结合导致RB荧光的恢复，荧光强度增强，从而显示出样品中鼠伤寒沙门氏菌浓度与荧光强度的线性关系，该方法在2×103～8×103CFU/mL呈现良好的线性关系，最低检测限为464 CFU/mL。此外，量子点的发现也开创了新的沙门氏菌检测方法，Wang Beibei等[35]基于最大发射量在514 nm（绿色发射）和578 nm（橙色发射）的量子点建立了FRET系统。肠炎沙门氏菌的结合导致FRET体系被破坏，双色量子点的能量共振转移被阻断，使得绿色发射量子点荧光强度上升，橙色发射量子点荧光强度下降，此荧光强度变化与沙门氏菌浓度有良好的线性关系，检测线性范围为75～5×105CFU/mL，检测限为10 CFU/mL。此方法检测的线性范围广、检测限低、操作简便，并可对沙门氏菌进行定量检测。

图3 无标记适配体沙门氏菌荧光生物传感器[26]Fig.3 Fluorescent biosensor with unlabeled aptamers for Salmonella detection[26]

2.1.4 化学发光生物传感器

物质间发生化学反应，由激发态到基态过程中产生的光辐照现象或者激发态物质经能量转移生成新物质并跃迁回基态而产生的光辐照现象都称为化学发光现象。基于化学发光现象设计的生物传感器使沙门氏菌简便、灵敏、可视化的检测成为可能。

Hao Liling等[27]采用适配体修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒作为捕获探针，N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺结合AuNPs作为信号探针，构建稳态的化学发光体系。此稳态化学发光传感器可特异灵敏地检测鼠伤寒沙门氏菌，线性检测范围为32～3.2×106CFU/mL，最低检测限为10 CFU/mL。另一项研究表明，Mn2+掺杂的NaYF4:Yb, Tm具有上转换发光特性，Mn2+掺杂的NaYF4:Yb, Tm上转换发光纳米粒子与AuNPs间可产生静电相互作用，导致发光猝灭现象的产生[36]。阻断它们之间的相互作用即可导致发光的恢复，因此，Cheng Keyi等[36]利用此现象制备了一种高灵敏度的发光生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌。AuNPs与适配体连接的上转换发光纳米粒子可产生发光猝灭现象，添加鼠伤寒沙门氏菌后，由于上转换发光纳米粒子-适配体-鼠伤寒沙门氏菌的形成而导致发光的恢复。根据发光的强度可反映鼠伤寒沙门氏菌的浓度，其线性范围为12～5×105CFU/mL，检测限低至11 CFU/mL。以上两种发光生物传感器利用物质独特的发光性能，无需任何标记，且操作简便、灵敏度高、线性检测范围广。

2.2 电化学沙门氏菌检测生物传感器

近年来电化学生物传感器由于其高灵敏度、高通用性、仪器的便携化受到人们的广泛关注[37]，这些传感器依赖于抗原、抗体、核酸、适配体等的生物偶联，将生物信号经电子、电阻传导转化为可以监测的化学信号。其中，最常见的生物传感器包括电流型生物传感器、阻抗型生物传感器、电导型生物传感器等。表2总结了不同电化学生物传感器在沙门氏菌检测中的应用，多数的电化学生物传感器实现了对沙门氏菌的定量检测，灵敏度高、检测时间短。其中，电流型生物传感器定量检测范围更广，对于电流的测定更为常见。因此，此传感器有望得到进一步的研究和完善，并得到推广。

表2 不同电化学生物传感器在沙门氏菌检测中的应用Table 2 Application of different electrochemical biosensors in Salmonella detection

2.2.1 电流型生物传感器

电流型生物传感器是基于电流变化作为生物信号放大标志的检测技术，通过生物信号产生离子聚合物电学特性的变化或者电子转移而引起电极表面电流的变化，从而将生物信号转变为电流信号。目前，已有多种电流型生物传感器应用于沙门氏菌的检测。

常用的电流型生物传感器以免疫学检测为基础，Silva等[40]基于聚合物离子选择电极对零电流离子流变化的高度敏感性原理，将AuNPs聚合物包膜涂附在自制电极表面，作为输出信号放大的元件，并作为抗体的固化平台。沙门氏菌结合前，电极内充液中离子流入达到稳定状态，加入沙门氏菌后，传感器表面的固定抗体与沙门氏菌结合引起离子通量的阻塞效应，从而产生电位的偏移，通过电位偏移量可检测样品中的鼠伤寒沙门氏菌（图4[40]）。检测时间小于1 h，检测限低至6 cell/mL。该方法的灵敏度高、操作简便、检测时间较短，但是无法进行沙门氏菌的定量检测。Rao等[45]采用DNA重组技术制备重组鞭毛融合蛋白包裹丝网印刷电极，形成鞭毛融合蛋白-血清沙门氏菌-磷酸酶标记抗体的检测平台，以碱性磷酸酶水解产生的1-萘酚作为安培法的检测信号，可灵敏地检测人血清中的沙门氏菌，并与健康人血清的检测结果形成明显的对照。此外，对苯二酚在辣根过氧化物酶存在的条件下氧化还原H2O2，可以引起峰值电流的降低，Ye Yongkang等[46]利用此电流信号的变化设计了一种检测沙门氏菌invA基因的电化学生物传感器。该方法将聚吡咯还原的氧化石墨烯纳米复合涂层在玻碳电极表面作为感应电流的信号元件，将辣根过氧化物标记的DNA与目标基因片段结合以催化对苯二酚与H2O2的氧化还原反应，该反应引起电化学信号的变化，实现了invA基因的检测。该生物传感器能重复稳定地检测沙门氏菌，检测范围为9.6～9.6×104CFU/mL，检测限为8.07 CFU/mL。

图4 沙门氏菌电位免疫传感器[40]Fig.4 Potential immunosensor for Salmonella detection[40]

2.2.2 阻抗型生物传感器

阻抗型生物传感器一般基于两种原理，一种是细菌生长产生的代谢物可以引起电导率的变化；另一种是细菌与电极表面的相互作用引起阻抗的变化[47]。目前，阻抗型生物传感器由于具有体积小、成本低、检测快的特点，已广泛应用于沙门氏菌的检测。

Mutreja等[48]在石墨烯-氧化石墨烯修饰的丝网印刷碳电极上连接沙门氏菌外膜蛋白D抗体作为鼠伤寒沙门氏菌的检测探针，抗体与沙门氏菌的特异性结合引起电极表面阻抗的变化，通过免疫传感器的阻抗变化来反映沙门氏菌的浓度，该方法可特异性地检测水和果汁中的沙门氏菌，检测灵敏度达10 CFU/mL。此外，纳米材料在阻抗生物传感器中的应用缩短了菌体富集的时间，使检测更加省时、灵敏度增强。Nguyen等[49]利用磁性二氧化硅纳米管（magnetic silica nanotubes，MSNTs）进行沙门氏菌的富集和阻抗免疫传感器信号的增强，鼠伤寒沙门氏菌抗体固定在交叉微电极上，鼠伤寒沙门氏菌与MSNTs上连接的抗体进行特异性结合，导致阻抗响应下降，从而实现沙门氏菌的检测。该传感器从细菌分离到检测完成仅需30 min，且对103～107CFU/mL下的鼠伤寒沙门氏菌有良好的阻抗响应。除抗体外，适配体与沙门氏菌的结合也在阻抗型生物传感器中得到了应用。Sheikhzadeh等[43]对适配体与伤寒沙门氏菌结合后影响吡咯-3-羧酸与吡咯共聚物的电学性能特性进行研究，沙门氏菌的结合引起体系中阻抗的变化，阻抗的变化量反映了样品中沙门氏菌的含量，其线性检测范围为102～108CFU/mL，定量限为100 CFU/mL，检出限为3 CFU/mL。

2.2.3 电导型生物传感器

电导型生物传感器以导电聚合物作为电化学转换器，将生物信号转化为电信号，通过电导率的变化反映细菌的浓度，从而实现对细菌的检测。聚苯胺作为常用的导电聚合物，由于其优良的液态稳定性、良好的电子特性以及较强的生物分子相互作用，已被应用于生物传感器。Muhammad-Tahir等[44]构建了由样品垫、结合垫、捕获垫和吸水垫组成的传感器。将聚苯胺结合的抗体固定于捕获垫上，捕获垫两端镀有银电极并与电子数据采集系统相连，以此形成电导型生物传感器。通过抗原与捕获垫上的抗体结合产生电导率的变化从而检测沙门氏菌。该方法检测限为79 CFU/mL，检测时间缩短至10 min，实现了较高的灵敏度以及快速检测的目的。与其他的电化学传感器相比，其制作方法简便，但是电导率与沙门氏菌浓度之间无线性关系，无法进行定量检测。

3 结 语

近年来，由沙门氏菌感染引起的食源性疾病越来越多，人们对沙门氏菌检测的关注度逐渐增强，沙门氏菌检测方法也在不断的更新。传统的沙门氏菌检测方法（如常规培养法、核酸分析法、免疫学检测法等）具有某些局限性。而基于免疫学和核酸分析的生物传感器检测技术由于灵敏度高、检测时间短、操作简便、不需要专门的操作技术而逐渐得到发展。

纳米材料的引入以及多种检测方法的结合使生物传感器在病原菌检测方面得到广泛应用。除常用的比色生物传感器和电化学生物传感器外，对压电生物传感器[50]的应用也进行了不断的创新。Han Song等[51]采用压电传感器结合连续流系统，实现了对粪便样品中艰难梭菌（Clostridium difficile）毒素B基因的直接检测。此外，微流控系统集成的生物传感器实现了多种病原菌的便携式检测[52]。An Xisen等[53]采用单细胞微流控芯片实现了鼠伤寒沙门氏菌的检测，检测限为50 CFU/mL，但检测时间较长（约5 h），无法实现现场直接快速的检测。核磁共振生物传感器也已用于牛奶中沙门氏菌的检测[54]，实现了2.4×104CFU/mL沙门氏菌的检测，该生物传感器抗干扰能力强、特异性强，有利于实现沙门氏菌的现场检测，但检测灵敏度有待提高。以上生物传感器的灵敏度、特异性和抗外界干扰能力得到了很大的提高，大大缩短了检测时间，并摆脱了传统检测方法对大型仪器设备以及操作人员的依赖性。但是，目前所研究的传感器无法实现多种沙门氏菌的同时检测；生物传感器的识别元件多为抗体，抗体制备周期长导致传感器生产周期长；且检测结果大多需要仪器读取等。因此，可以将电化学的稳定性以及光学的可视化相结合，并引入纳米材料进行生物信号的放大，不断地缩短检测时间和降低成本，实现检测结果的可视化、检测设备的便携性和微型化；另外，纳米抗体作为一种高特异性、高亲和力的新型抗体，其分子质量小、结构简单，能在工程菌中大量表达，在室温下保存相当稳定，具有较高的耐热性和稳定性，可以代替普通抗体，理论上能够延长生物传感器的使用时间、提高稳定性。生物传感器在沙门氏菌的检测方面发挥了重大作用，未来将会得到进一步的研究与推广，甚至在所有食源性致病菌检测中得到广泛应用。