竹叶抗氧化物/酪蛋白酸钠/乳清分离蛋白可食膜的制备和性能分析

汪 敏，陈洁莹，徐 磊,,*，蒋希芝，冯 敏

（1.农业农村部长江中下游设施农业工程重点实验室，江苏省农业科学院农业设施与装备研究所，江苏 南京 210014；2.江苏银宝农业科学研究院有限公司，江苏 盐城 224014）

可食膜是以天然生物大分子为基材，添加增塑剂等辅助成分制成的一种可食用、绿色环保、具有保鲜功能的包装材料。可食膜主要通过阻碍水分、气体和溶质等的迁移来防止食品变质和微生物污染，延长食品货架期[1]。基于对环境资源保护和食品安全性等问题的考量，近年来可食膜的制备和应用逐渐成为国内外研究的热点[2-3]。

乳清分离蛋白是奶酪加工工业中的一种副产物，具备可食用、阻隔性优、可生物降解等优良性能[4]，同时具备较佳的成膜能力，可以制备成透明度高、柔韧性好的高分子膜[5]。目前，国内外关于乳清蛋白膜制备和应用的报道较多。Osés等[6]用乳清蛋白可食膜保护富含多不饱和脂肪酸的食品；Silva等[7]将果胶添加至乳清分离蛋白中以改善可食膜的性能。蛋白膜的成膜机理是蛋白质分子在加热条件下三级结构发生变化，内部基团暴露出来，在干燥过程中蛋白分子间生成新的二硫键，得到结构致密的膜[8]。而多种蛋白分子同时加热变性，干燥过程中蛋白链间发生更强烈的交联，所形成膜性质更优[9]。酪蛋白酸钠具有较好的热稳定性，分子中含有疏水基团和亲水基团，具有良好的成膜性、阻气性和乳化性[10]。雷桥[11]将乳清分离蛋白与酪蛋白酸钠结合制备成复合蛋白膜，其可作为一种绿色环保的可食性包装材料。

食品在贮藏过程中易受微生物的侵害，而蛋白膜自身营养丰富，在食品保鲜应用中存在抗菌性能不足的劣势[12]。在蛋白溶液中添加抗氧化剂、抗菌剂等所制备的复合膜对食品的保鲜可能具有更好的效果[13-14]。Ramos等[15]将乳酸、低聚壳聚糖等添加至乳清分离蛋白中以提高可食膜的抗菌性能。竹叶抗氧化物是从一至两年生的竹叶中提取的抗氧化物质，有效成分包括黄酮类、酚酸类和内酯类化合物，具有较强的抗氧化和抑菌作用[16]。鉴于其理化性质较稳定、安全性高、天然营养、可生物降解等诸多优点，现已初步应用于各类食品中[17-18]。目前鲜见将竹叶抗氧化物添加至乳清蛋白成膜液中以增强可食膜的抗菌、抗氧化性的报道。本实验以乳清分离蛋白为成膜基材，添加竹叶抗氧化物、酪蛋白酸钠以甘油为增塑剂，采用延流成膜法制备竹叶抗氧化物/酪蛋白酸钠/乳清分离蛋白复合可食膜（antioxidant of bamboo leaves/sodium caseinate/whey protein isolate composite film，ASWF）。分析各成膜因素（成膜材料质量比、pH值、甘油质量浓度）对可食膜性能的影响，并对可食膜进行结构表征及保鲜效果测定，以期为竹叶抗氧化物的应用及可食膜的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白（蛋白质量分数高于90%） 美国Hilmar公司；酪蛋白酸钠（食品级） 上海麦克林生化科技有限公司；甘油（食品级） 济南双萍化工科技有限公司；水溶性竹叶抗氧化物（黄色或棕黄色的粉末，无异味；总黄酮质量分数不低于30%） 上海梦荷生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

标准单用型螺旋测微器（0.001 mm） 东莞晶研仪器科技有限公司；FA2004电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；85-2恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；S20台式pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HH-8数显恒温水浴锅 常州智博瑞仪器制造有限公司；SD恒温恒湿箱 天津塞得利斯实验分析仪器制造厂；GZX-9070数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司；HY-0580电子万能材料试验机 上海衡翼精密仪器有限公司；UV-3200PC紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；Nicolet iS-50傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo Scientific公司；EVO-LS10扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 德国Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 可食膜的制备

图1为ASWF的制备流程。称取乳清分离蛋白10 g，于100 mL常温去离子水中搅拌溶解；称取适量酪蛋白酸钠，分散于去离子水中；称取适量竹叶抗氧化物，分散于去离子水中。将上述3 种溶液混合，加入适量甘油，调节pH值，磁力搅拌，充分混合后将其于85 ℃恒温水浴中加热30 min，使蛋白质变性，制备成复合蛋白膜溶液。将成膜溶液真空脱气（0.09 MPa、2 h），平板延流，55 ℃恒温鼓风干燥成膜。将干燥后的膜样品置于恒温恒湿箱（23 ℃、相对湿度50%）中平衡48 h，然后进行性能指标测定。

图1 可食膜制备工艺流程Fig.1 Flow chart of the preparation process of edible films

1.3.2 膜性能指标测定

1.3.2.1 厚度

在可食膜样品上随机均匀选取5 个测量点（中间1 个、周围4 个），采用螺旋测微器测量其厚度，计算平均值，单位mm。

1.3.2.2 机械性能

参考GB/T 1040.1—2018《塑料 拉伸性能的测定第1部分：总则》[19]和GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄膜和薄片的试验条件》[20]，采用电子万能材料试验机测定可食膜的断裂拉伸强度及断裂伸长率。将样品膜裁剪成150 mm×20 mm的矩形，固定在仪器夹具上，实际测量长度为100 mm，测试速率为300 mm/min，每个样品平行测10 组，计算平均值。断裂拉伸强度和断裂伸长率分别按公式（1）、（2）计算。

式中：F为试样发生断裂时对应负荷/N；b为试样宽度/mm；h为试样厚度/mm；D为试样断裂时的标距/mm；L为试样测量初始标距/mm。

1.3.2.3 水蒸气透过量

膜的水蒸气透过量的测定参照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》[21]，将提前烘干的无水CaCl2放入量杯中，表面铺平至杯口3 mm位置。将可食膜样品水平紧密固定于杯口，称质量后将量杯放入恒温恒湿箱中（38 ℃、相对湿度90%），每隔一定时间称量量杯的质量。每个样品平行测3 组，水蒸气透过量按公式（3）计算。

式中：Δm为t时间内试样增加的质量/g；A为样品透水蒸气的面积/m2；t为质量增量稳定后的2 次时间间隔/h。

1.3.2.4 透光率

参照GB/T 2410—2008《透明塑料透光率和雾度的测定》[22]分光光度计法测定透光率，采用紫外-可见分光光度计测定可食膜的透光率。将可食膜剪成合适的大小，放置在比色皿内，使入射光束垂直通过样品，在560 nm波长处读取透光率。以不放置样品时透光率为100%作为对照，每个样品平行测3 组，取平均值。

1.3.3 可食膜制备单因素试验

取适量乳清分离蛋白、竹叶抗氧化物、酪蛋白酸钠，按1.3.1节步骤制备可食膜。考察成膜材料质量比、pH值、甘油质量浓度等因素对可食膜性能指标的影响。根据预实验结果设计因素水平（表1）。对某一因素进行考察时，其他因素均选取水平3的参数进行试验。所有实验均重复3 次，取平均值。

表1 单因素试验因素水平Table 1 Factors and their coded and actual levels used for single factor experiments

1.3.4 可食膜傅里叶变换红外光谱分析

采用Nicolet iS-50傅里叶变换红外光谱仪测定可食膜的红外吸收光谱，光谱范围525～4 000 cm-1，扫描次数32，分辨率4.000 cm-1。

1.3.5 可食膜SEM观察

采用SEM观察可食膜的表面和截面形貌。利用导电胶带将适量可食膜样品黏至样品台，用离子溅射仪在样品表面镀厚度10 nm的金膜，然后放入显微镜腔室中进行扫描。可食膜的表面形貌和截面形貌分别在放大1 000 倍和500 倍条件下观察。

1.3.6 可食膜的保鲜实验

以未经消毒灭菌处理的鱿鱼干样品为试样，进行可食膜对实际样品的保鲜实验。

不添加竹叶抗氧化物，其他条件选择制备ASWF的最优水平，制备乳清蛋白膜，比较乳清分离蛋白膜与ASWF对鱿鱼干的保鲜效果。以未经灭菌处理的鱿鱼干为试样，对照组直接用普通聚乙烯（polyethylene，PE）膜进行包装，实验组分别用乳清分离蛋白膜和ASWF进行内包装后再用普通PE膜进行包装。包装好的样品于室温（（25±2）℃）下存放7 d后，从与包装袋直接接触的鱿鱼干表层取样检测菌落总数和过氧化值，每组设置3 个平行，取平均值。菌落总数、过氧化值的测定分别参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[23]、GB 5009.227—2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[24]。

1.4 数据处理与分析

所有实验数据采用SAS 9.1软件进行统计分析，显著性分析采用Duncan’s法，采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 可食膜的厚度

膜材料的厚度会影响其机械强度和阻隔性。在可食膜的制备过程中，对其厚度影响较大的因素是成膜材料的质量比[25]。如表2所示，随着成膜材料质量比的变化，膜的厚度没有明显的变化规律，在0.056～0.064 mm之间，且各厚度之间没有显著差异（P＞0.05）。Mostafavi等[26]研究表明，成膜过程中每单位平板面积的薄膜溶液干质量是保持不变的。因此可推测，在薄膜性能指标的测定分析中，任何差异都不是由于厚度不同造成的。

表2 成膜材料质量比对可食膜厚度的影响Table 2 Effect of film-forming material composition on thickness of edible films

2.2 单因素试验结果

2.2.1 成膜材料质量比的影响

表3为成膜材料质量比对可食膜断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量和透光率的影响。随着竹叶抗氧化物含量的增加，断裂拉伸强度呈先增大后减小的趋势。当m（竹叶抗氧化物）∶m（酪蛋白酸钠）∶m（乳清分离蛋白）为1∶1∶10时，断裂拉伸强度达到最大值（17.10 MPa）。这是因为在加热条件下，乳清分离蛋白和酪蛋白酸钠两者的蛋白分子变性，分子内部的部分二硫键、巯基和疏水基团暴露出来，在干燥过程中，蛋白链间发生更强烈的反应，形成分子间的交联网状结构[27-28]。而竹叶抗氧化物的小颗粒有效分布在乳清分离蛋白/酪蛋白酸钠大分子网状结构中，形成了更加致密的分子结构，导致断裂拉伸强度增大。而继续增多的竹叶抗氧化物可能会发生团聚现象，使其在乳清分离蛋白/酪蛋白酸钠网状结构中分布不均，一定程度上破坏了可食膜均匀致密的结构，因此断裂拉伸强度出现下降现象。同时，竹叶抗氧化物中含有的小颗粒物质会带来一定的分子内作用力，减小了膜的拉伸柔韧性，因此断裂伸长率下降。

随着竹叶抗氧化物比例的增加，膜的水蒸气透过量呈减小趋势。这是因为竹叶抗氧化物中黄酮、酚酸、内酯等活性物质的小尺寸效应一定程度增加了可食膜的比表面积，其含有的—OH基团暴露出来，与乳清分离蛋白形成氢键，使水分子通过膜的路径更为曲折。同时，黄酮、酚酸、内酯等小分子的加入使薄膜的透光率整体呈缓慢下降趋势。隋思瑶等[29]在乳清蛋白膜中添加山梨醇，薄膜的透湿性和透光率也出现下降的现象。

综合考虑复合膜的断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量、透光率等，选择成膜材料质量比m（竹叶抗氧化物）∶m（酪蛋白酸钠）∶m（乳清分离蛋白）＝1∶1∶10较为合适。

表3 成膜材料质量比对可食膜性能的影响Table 3 Effect of film-forming material composition on performance of edible films

2.2.2 pH值的影响

图2 pH值对可食膜性能的影响Fig.2 Effect of film-forming solution pH on performance of edible films

图2 为p H 值对可食膜断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量和透光率的影响。随着pH值的增大，可食膜的断裂拉伸强度、断裂伸长率呈先增大后减小趋势，pH值为8～9时，断裂拉伸强度和断裂伸长率较高。分析原因可能为酪蛋白酸钠在碱性条件下乳化能力较强，乳清分离蛋白在pH值达到9时黏度大幅增加[30]。因此在pH 8～9范围内，乳清分离蛋白/酪蛋白酸钠分子结构融合性好，也促进了竹叶抗氧化物在乳清分离蛋白/酪蛋白酸钠分子结构中的分布，导致膜的结构致密，所以断裂拉伸强度、断裂伸长率增大。而当pH值继续增大，蛋白分子开始发生碱水解，膜结构被破坏，因此断裂拉伸强度和断裂伸长率均出现下降[31-32]。同理，可食膜的水蒸气透过量在pH值为8～9时较低，此时膜的结构较为致密，阻碍水蒸气的通过。pH 6～10范围内，膜的透光率呈缓慢上升趋势，整体变化不明显。

综合考虑复合膜的断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量、透光率等，选择pH值为8～9较为合适。

2.2.3 甘油质量浓度的影响

图3 甘油质量浓度对可食膜性能的影响Fig.3 Effect of glycerol concentration on performance of edible films

图3为甘油质量浓度对可食膜断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量和透光率的影响。随着甘油质量浓度由0.02 g/mL上升至0.06 g/mL，膜的断裂拉伸强度由21.0 MPa下降至16.1 MPa，而膜的断裂伸长率由26.5%上升至37.4%。这是因为添加甘油后，甘油进入到膜的大分子链间，破坏原来的分子结构，使分子间作用力减弱，所以断裂拉伸强度减小。此外，甘油能增加膜溶液中的黏稠度，增强分子链流动性，使制得的复合膜柔韧性更强，所以断裂伸长率增大[33]。随着含油量的增大，复合膜的机械阻力减弱，拉伸性能增强，该结果与Galus等[34]的研究结果一致。

膜的水蒸气透过量随着甘油质量浓度的增加呈先减小后增大的趋势。甘油作为增塑剂，含有亲水基团，具有较强极性。甘油的加入可与成膜大分子间形成氢键等化学键，一定程度上阻碍了水分子的通过，因此水蒸气透过量呈现下降的趋势。而当甘油的用量继续增加，其与成膜大分子间形成的氢键键合力已经大于各分子内的氢键键合力，导致膜的分子结构中产生空隙[35]。同时甘油会在膜的表面吸附水蒸气，加快水蒸气通过膜的扩张速率，从而提高膜的水蒸气透过性能[36]。李帅等[37]在大豆分离蛋白可食膜工艺优化中也发现随着甘油质量浓度的增加，可食膜透湿性呈先减小后增大的趋势。随着甘油质量浓度的增加，薄膜透光率逐渐增大。食品包装材料具备较低的透湿率和透光率，有利于阻止水分和光照对食品品质的损坏。

综合考虑复合膜的断裂拉伸强度、断裂伸长率、水蒸气透过量、透光率等，选择甘油质量浓度为0.04 g/mL较为合适。在此条件下，制备的ASWF断裂拉伸强度和断裂伸长率分别为18.4 MPa、32.8%，水蒸气透过量和透光率分别为10.86 g/（m2·d）、90.2%。

2.3 可食膜傅里叶变换红外光谱分析结果

图4为成膜材料（乳清分离蛋白）和可食膜ASWF在波数525～4 000 cm-1处的傅里叶变换红外光谱图。其中乳清分离蛋白的特征吸收峰主要有3 277 cm-1附近出现的N—H伸缩振动峰、2 927 cm-1和2 853 cm-1附近的C—H键伸缩振动峰。1 635 cm-1附近为酰胺I带C—O伸缩振动峰，1 526 cm-1和1 389 cm-1附近分别为酰胺II带N—H弯曲振动吸收峰和酰胺III带N—H变形峰及C—N伸缩振动峰。竹叶抗氧化物的特征吸收峰主要有3 264 cm-1附近的酚羟基吸收峰、2 981 cm-1和2 885 cm-1附近的饱和C—H伸缩振动特征吸收峰；羰基的伸缩振动区域在1 900～1 500 cm-1，1 680 cm-1和1 604 cm-1附近为黄酮羰基吸收峰；1 442 cm-1附近为苯环骨架振动峰，885 cm-1附近为C—H的弯曲振动吸收峰。这些吸收峰与前人研究所得黄酮类化合物吸收峰[38-39]一致。

将ASWF的吸收峰与乳清分离蛋白和竹叶抗氧化物的吸收峰对比，发现ASWF在乳清分离蛋白的基础上增加了1 442 cm-1附近的苯环骨架振动峰、885 cm-1附近C—H的弯曲振动峰，均为竹叶黄酮的特征峰。同时，其酰胺I带、酰胺II带和酰胺III带的吸收峰出现位置分别在波数1 617、1 511 cm-1和1 405 cm-1处。和乳清分离蛋白相比，ASWF的酰胺I带和酰胺II带向低波数方向移动，酰胺III带向高波数方向移动，说明在成膜过程中，各组分间形成了新的共价键或者氢键，使ASWF分子整体结构发生了一些变化，宏观上表现为ASWF具有良好的抗拉强度，微观上表现为ASWF内部结构乳化致密。

图4 可食膜傅里叶变换红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of edible films

2.4 可食膜SEM图观察结果

图5 为最优工艺条件制备得到的乳清分离蛋白和ASWF表面和截面的SEM图，可清晰地观察到可食膜体系内部结合情况。通过观察可知，乳清分离蛋白膜表面形貌平整光滑、成膜均匀；ASWF表面比较平整，大部分区域成膜均匀，小部分区域分布有颗粒状物质团聚。古丽巴哈尔·卡吾力等[40]在对枸杞黄酮的研究中发现，SEM比例尺100 μm条件下观察到枸杞黄酮存在聚集态，因此推测图5A2中10 μm比例尺下观察到的ASWF中颗粒状物质可能为竹叶提取物中黄酮等小分子的聚集物。图5B1和图5B2中膜的截面形貌均呈网状结构分布，无分层现象。但乳清分离蛋白膜中有少许孔洞出现，ASWF呈现出更为致密的结构。这说明加入竹叶抗氧化物后，成膜液中蛋白分子与黄酮、酚酸等小分子物质分散更加均匀，相容性更好，分子间各基团发生相互作用，产生较强的吸引力，促进了各分子间的交联。类似研究发现，多酚化合物与大豆蛋白之间的相互作用导致蛋白膜链间空间减少，结构更紧密[41-42]。

图5 乳清分离蛋白和ASWF SEM图Fig.5 SEM images of WPI and ASWF edible films

2.5 可食膜对鱿鱼干的保鲜效果

鱿鱼干营养丰富，适合微生物生存，脂肪含量较高、容易氧化，商品价值易受到影响。表4为各组鱿鱼干在室温下贮藏7 d后菌落总数和过氧化值的测定结果。经检验，鱿鱼干样品的初始菌落总数为7.53×104CFU/g，初始过氧化值为0.216%。存放7 d后，普通PE膜和乳清分离蛋白膜包装的鱿鱼干菌落总数分别为3.12×105、2.86×105CFU/g，过氧化值分别为0.285%、0.276%。A S W F 包装的鱿鱼干菌落总数和过氧化值分别为7.84×104CFU/g、0.224%。可见，乳清分离蛋白膜对抑制鱿鱼干微生物繁殖和脂肪氧化有一定的效果，而添加竹叶抗氧化物后制得的ASWF对鱿鱼干贮藏保鲜有更明显的作用。有研究表明，竹叶提取物中的黄酮类物质[43]、酚类物质[44]具有良好的抑菌效果，因此ASWF能够抑制鱿鱼干中微生物增长。同时，竹叶抗氧化物中含有的黄酮、多酚、多糖等活性物质具有抗氧化作用，能够抑制鱿鱼干脂肪氧化。楼鼎鼎等[45]的研究也表明，添加竹叶抗氧化物提高了中式香肠的抗氧化性能。

表4 贮藏7 d可食膜对鱿鱼干的保鲜效果Table 4 Effect of edible films on preservation of dried squid after preservation of 7-day

3 结 论

通过单因素试验考察可食膜的性能指标，得到ASWF的最佳制备条件：成膜材料m（竹叶抗氧化物）∶m（酪蛋白酸钠）∶m（乳清分离蛋白）为1∶1∶10，pH值为8～9，甘油质量浓度为0.04 g/mL。在此条件下，得到的可食膜断裂拉伸强度和断裂伸长率分别达18.4 MPa和32.8%，水蒸气透过量为10.86 g/（m2·d），透光率为90.2%，具备良好的物理性能。傅里叶变换红外光谱和SEM表征结果显示成膜材料之间具有良好的相容性。保鲜实验结果表明，贮存7 d后，ASWF包装的鱿鱼干菌落总数和过氧化值分别为7.84×104CFU/g、0.224%，明显低于普通PE膜（3.12×105CFU/g、0.285%）。添加竹叶抗氧化物提高了可食膜对鱿鱼干的保鲜效果，ASWF具备良好的微生物抑制作用和抗氧化作用。

本实验以竹叶抗氧化物、酪蛋白酸钠和乳清分离蛋白为原材料制备可食膜，拓宽了竹叶抗氧化物的应用范围，在可降解保鲜包装领域有较好的应用前景。