小黑杨HD-Zip转录因子PsnHB63基因克隆及表达分析

韩连斌 国 庆 赵 凯 姜廷波 周博如 李 莉

（东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040）

转录因子（Transcription factor）也称反式作用因子，是具有已知DNA 结合域结构特征的蛋白质分子［1］。同源异型域-亮氨酸拉链蛋白（HD-Zip）属于同源异型盒（homeobox，HB）蛋白家族，包含高度保守的同源异型域（HD）和与其末端紧密相连的亮氨酸拉链域（LZ）［2～3］。HD 区是由3 个α 螺旋组成的三维空间结构；LZ 区一般是由5～6 个亮氨酸（Leu）残基组成［4］。HD-Zip 转录因子存在同源或异源二聚体，能与DNA相结合，从而控制基因的表达。因此，同源异型域和亮氨酸拉链结构域的空间排列对于HD-Zip 转录因子特异性结合DNA序列起到了很关键的作用［5］。根据基因序列的保守性及结构特点，HD-Zip 家族可被分为4 个亚族，HD-Zip Ⅰ-Ⅳ6］：其中，HD-Zip Ⅰ亚族只包含HD 和LZ 结构域，主要参与植物对逆境胁迫的应答反应［7～8］、植物光信号转导［9］、叶片和种子的发育调节［10～11］等过程；HD-Zip Ⅱ亚族另有N 端保守区域（N-term）和CPSCE 保守结构域［12］，在避荫反应［13］、介导植物对光质改变时的应答［14］和响应非生物胁迫［15］等过程中发挥着重要作用；HD-Zip Ⅲ亚族比HD-Zip Ⅰ亚族多了START、SAD 和MEKHLA 结构域［16］，具有抑制转录的作用，主要参与植物分生组织的形成［17］、植物胚胎发育［18］和植物维管发育［19］等；HD-Zip Ⅳ亚族与HD-Zip Ⅲ亚族类似，但是没有MEKHLA 结构域［20］，主要参与植物表皮细胞的发育［21］、植物物质积累及运输［22］以及在植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫过程中起重要作用［23］。目前，许多植物都已经对HD-Zip 蛋白的的基因功能进行了分析和研究，如拟南芥［24］、玉米［25］、水稻［26］、黄瓜［27］、大豆［28］、龙眼［29］等。拟南芥HD-ZipⅠ亚族中参与非生物胁迫的基因有ATHB1、ATHB5、ATHB6、ATHB7和ATHB12［30］。有研究报道AtHB1只与TBP 相互作用，AtHB7与TBP 和TFIIB 相互作用，AtHB12只与TFIIB 相互作用，而AtHB13与TBP和TFIIB 没有显著的相互作用［31］。在HD-ZipⅡ亚族中其基因及启动子识别的目标序列与其所含有的DNA 结合基序一致，导致该亚族内可能会形成复杂的调节网络，其亚族中的任何一个成员都可以调节包括自己在内的所有蛋白的表达［32］。HDZipⅢ亚族的蛋白活性会被许多基因调控，例如，miR165/166 家族可结合到HD-ZipⅢ的START 区，限制其mRNA在细胞中转录后水平的积累，而在上游还有AGO10 和HYL1 基因可以诱导miR165/166家族的表达可以控制HD-ZipⅢ蛋白的活性［33］。

在拟南芥中报道的AtHB7基因是PsnHB63在拟南芥中的同源基因，已被证明参与了ABA 以及非生物胁迫的调节过程，在水分不足或ABA 处理下其表达会上调，同时还受盐胁迫和渗透胁迫的诱导［34］。这证明HB63是一个关键的关于非生物胁迫的转录因子，也给我们研究杨树的非生物胁迫提供了理论基础。杨树是目前研究林木遗传转化的木本模式植物。小黑杨（Populus simonii×P.nigra）是小叶杨和黑杨杂交而来［35］，小黑杨的材质细密，色白，心材不明显，生长快，适应能力很强，是东北地区的推广品种。但在小黑杨中并没有研究过HB63基因。所以本研究为探明小黑杨PsnHB63基因应答高盐及干旱两种肋迫的表达特点，克隆PsnHB63基因，并进行生物信息学分析，用qRTPCR 分析PsnHB63基因在NaCl、干旱胁迫条件下的表达特性。为研究PsnHB63基因在杨树抗逆中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 PsnHB63基因克隆

根据NCBI 基因库毛果杨（Populus trichocarpa）HD-Zip 基因序列（Potri.002G176300.1）设计引物（见表1）。使用试剂盒提取一个月的小黑杨组培苗的总RNA，并反转录成cDNA 后进行PCR 克隆，送至哈尔滨擎科生物公司测序。

表1 HB63基因克隆及定量分析引物和载体引物Table 1 HB63 gene cloning and quantitative analysis primers and vector primers

1.2 PsnHB63 基因及蛋白质序列的生物信息学分析

使用ExPasy 的Protparam 在线分析PsnHB63氨基酸的理化性质；使用ProtScal 在线分析Psn-HB63 蛋白的亲疏水性；使用Singa-P 对PsnHB63蛋白进行信号肽预测；使用TMPred 在线预测Psn-HB63 蛋白的跨膜结构；分别使用SOMPA 和Swissmode对蛋白的二级结构和三级结构进行在线预测和分析；运用NCBI 对PsnHB63基因序列进行同源序列比对，并利用MEGA 软件（V5.2）构建系统进化树；用Yloc 在线软件预测PsnHB63的亚细胞定位情况。

1.3 植物表达载体pBI121-PsnHB63-GFP 的构建

根据载体pBI121-GFP 和PsnHB63基因序列全长，设计含XbaⅠ和SpeⅠ酶切位点的引物（见表1），PCR 克隆后双酶切反应并胶回收，将纯化后的pBI121-GFP 载体酶切产物与PsnHB63基因酶切产物用T4 DNA 连接酶连接，连接产物热激法转化到大肠杆菌TOP10 感受态中，将得到的阳性克隆菌落送至哈尔滨擎科生物公司测序。

1.4 基因枪瞬时转化

构建PsnHB63基因的瞬时表达载体（pBI121-PsnHB63-GFP）。将提取的质粒包裹钨粉，用基因枪（PDS-1000/He Particle Delivery System）轰击洋葱表皮，并在激光共聚焦显微镜（Olympus-FV1000MPE）下观察亚细胞定位情况。

1.5 盐和甘露醇胁迫处理下PsnHB63 基因表达分析

将长势良好、长势相似的1个月小黑杨组培苗土培1个月（相对湿度70%、每日14 h光照、平均温度25℃），将材料分为45 组，每3 组进行同一处理。分别用水（对照组）、0.15 mol·L-1NaCl 胁迫处理和甘露醇模拟干旱处理0、3、6、12 和24 h 后，提取样本根、茎、叶的RNA，将其反转录成cDNA，用BLAST 预测PsnHB63的保守结构域，并设计qRTPCR引物（见表1），荧光定量仪器型号为ABI7500，使用TaKaRa 荧光定量试剂盒，检测目的基因的表达水平。以内参基因ACT 为对照，用2-ΔΔCT计算法计算其相对表达量。

2 结果与分析

2.1 小黑杨PsnHB63基因序列及理化性质

利用PCR 扩增克隆获得全长717 bp 的Psn‐HB63基因序列（见图1），与毛果杨基因库序列相似性为99.02%。利用NCBI 对基因序列的分析可知PsnHB63基因的开放读码框717 bp，推测其编码238 个氨基酸（见图2）。使用ExPasy 在线Protparam 软件预测出PsnHB63 蛋白的分子式为C1186H1860N332O387S10；原子总数为3 775；相对分子量为27 282.41；带负电荷的残基数（Asp+Glu）为42，带正电荷的残基数（Arg+Lys）为34；理论等电点（pI）为5.04；脂肪系数为59.87；消光系数为39 085；总平均亲水性为-0.938，属于亲水性蛋白；不稳定系数为60.05，属于不稳定蛋白。

2.2 小黑杨PsnHB63蛋白信号肽、跨膜结构域及亲疏水性的预测与分析

通过在线软件SignalP 预测PsnHB63 蛋白信号肽，结果表明该蛋白不存在信号肽（见图3A）。预测结果说明PsnHB63 蛋白不是分泌蛋白或是一些细胞质基质中合成的运输到细胞器中起作用的蛋白质，PsnHB63 蛋白合成后就于合成处发挥作用，不存在运输。通过TMpred 软件预测PsnHB63蛋白的跨膜结构域，结果表明该蛋白不存在跨膜结构（见图3B），说明PsnHB63 蛋白不是定位于生物膜的膜蛋白。通过在线软件ExPASy 的ProtScale 程序中的Kyteand Doolitlle 算法分析Psn-HB63 蛋白亲疏水性，结果显示分值为负的氨基酸多于分值为正的氨基酸，即亲水大于疏水，因此推测PsnHB63蛋白是亲水蛋白（见图3C）。

2.3 PsnHB63 蛋白结构域及二、三级结构预测分析

使用NCBI 预测PsnHB63 蛋白保守结构域（见图4）。经过分析得出该蛋白包括Homeobox 结构域和HALZ 结构域。Homeobox 结构域由第35 到84 的50 个 氨 基 酸 组 成，HALZ 结 构 域 由 第86 到127的42个氨基酸组成。

使用SOMPA 在线软件对PsnHB63 蛋白的二级结构预测（见图5A）。结果显示该蛋白的二级结构由39.08%的α 螺旋（Alpha helix）、6.30%的延伸链（Extended strand）、1.68%的β 转角（Beta turn）和52.94%的无规则卷曲（Random coil）组成。使用在线软件ExPASy 的SWISS-MODLE 程序对Psn-HB63蛋白三级结构进行同源建模（见图5B）。

2.4 PsnHB63基因的同源性分析

在线比对氨基酸序列，将小黑杨PsnHB63基因的氨基酸序列与相同基因的其他植物的氨基酸序列进行同源性比对，结果显示，小黑杨与毛果杨（Populus trichocarpa）、银白杨（Populus alba）、胡杨（Populus euphratica）、木薯（Manihot esculenta）等物种同源蛋白序列具有高度保守性（见图6）。根据以上的比对结果，对这12 个物种的PsnHB63 蛋白构建系统发育树（见图7）。12 个物种中小黑杨PsnHB63与毛果杨、银白杨、胡杨的HD-Zip蛋白遗传距离较近，说明它们在进化的过程中亲缘关系较为密切，与欧洲油橄榄、黄胡萝卜的HD-Zip 蛋白遗传距离最远，说明它们进化的亲缘关系也最远，与其他物种的HD-Zip 蛋白进化的亲缘关系较远。

2.5 PsnHB63基因亚细胞定位实验结果

观察洋葱表皮细胞中的GFP 荧光蛋白表达情况，结果表明，在转入对照pBI121-GFP 空载质粒的洋葱表皮细胞中均有荧光信号（见图8A），而转入pBI121-PsnHB63-GFP 表达载体的洋葱表皮细胞仅在细胞核中发现绿色荧光信号（见图8B），说HB63-GFP定位在细胞核，与预测分析结果一致。

2.6 盐和甘露醇胁迫处理下小黑杨PsnHB63 基因表达分析

在0.15 mol·L-1NaCl 胁迫条件下，小黑杨茎和叶中的PsnHB63基因表达量呈现先升高后下降的趋势，但总体是上调趋势；小黑杨根中的PsnHB63基因表达量呈现先升高后下降的趋势，但只在盐胁迫12 h 之前是上调趋势，在24 h 为下调趋势。以胁迫0 h 的PsnHB63基因在小黑杨根茎叶中的表达量为对照组，根中在12 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的2.3 倍；茎中在3 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的5.7 倍；叶中在6 h表达量达到最高，约为对照组表达水平的8.2 倍（见图9）。

在甘露醇模拟干旱处理下，小黑杨根和茎中的PsnHB63基因表达量呈现先升高后下降的趋势，但总体是上调趋势；小黑杨叶中的PsnHB63基因表达量先升高后基本持稳，但总体是上调趋势。以胁迫0 h 的PsnHB63 基因在小黑杨根茎叶中的表达量为对照组，根中在12 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的4.7 倍；茎中在12 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的6.6 倍；叶中在6 h表达量达到最高，约为对照组表达水平的5.3 倍（见图10）。

3 讨论

植物经常会受到各种各样的不适合生长、发育的生物、非生物胁迫（如干旱、高盐和低温）的影响。许多研究表明，HD-Zip 类转录因子参与了不同植物对各种非生物胁迫的反应。AtHB12基因在拟南芥中、HaHB4基因在向日葵中以及ZmHDZ4基因在玉米中的表达或过表达，HD-Zip 转录因子均增强了植物对干旱或盐胁迫的耐受性［36-38］。苜蓿HD-ZipⅡ亚族的MTHB1基因在盐胁迫下能提高植物的耐盐能力［39］。以上研究都表明，HD-Zip基因在非生物胁迫反应中发挥着重要作用。

本研究从小黑杨中克隆出717 bp 的PsnHB63转录因子，该基因共编码238 个氨基酸。通过对PsnHB63的氨基酸序列进行保守结构域的预测得知该蛋白包括Homeobox 结构域和HALZ 结构域；并通过预测得知该蛋白是不含信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。其二级结构是由39.08%的α螺旋、6.30%的延伸链、1.68%的β转角和52.94%的无规则卷曲组成。亚细胞定位结果证明了PsnHB63基因定位在细胞核中。对生长状态相同的小黑杨进行不同时间的盐胁迫处理和甘露醇模拟干旱处理，通过RT-PCR 结果表明，在盐胁迫处理下Psn‐HB63基因在茎和叶中的表达量显著上调，在根的表达量12 h 前上调，在24 h 时下调；其中根在12 h表达量达到最高，约为对照组表达水平的2.3 倍；茎在3 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的5.7 倍；叶在6 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的8.2 倍；甘露醇模拟干旱处理下PsnHB63基因在根茎叶中的表达量均显著上调；其中根在12 h表达量达到最高，约为对照组表达水平的4.7倍；茎在12 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的6.6 倍；叶在6 h 表达量达到最高，约为对照组表达水平的5.3 倍。以上结果表明PsnHB63基因可能参与了小黑杨的渗透胁迫过程，属于逆境胁迫调控因子。