化学融雪剂对土壤微生物活性及氮转化的影响

张 营，李法云，孙婷婷，张国徽，程志辉，李 霞

(1.辽宁大学环境学院，辽宁 沈阳 110036;2.湖南农业大学资源环境学院，湖南 长沙 410128)

化学融雪剂是国内外寒冷地区冬季除雪化冰、保证交通安全的主要措施之一，包括有机融雪剂和无机融雪剂两大类。随着氯盐类融雪剂长期使用引发的水体、土壤、植被和野生动物等一系列生态环境问题受到广泛关注以来，环保型融雪剂越来越受到人们的重视[1]。但因有机融雪剂价格或除雪效果的原因，该类融雪剂的使用一般仅限于机场、港口和桥梁等局部范围，仍未大规模普及。融雪剂中的盐离子含量极可能对环境特别是土壤微生物产生影响，同时融雪剂导致冰点降低，也可能影响水溶性营养元素的有效性并刺激微生物活性。以NaCl为例，10%的NaCl溶液可将冰点降低至-6 ℃，20%的融冰盐溶液可将冰点降至-16 ℃，当向100 g冰或雪中加入33 g NaCl冰点可降至-21 ℃以下。然而，这些融雪机制对土壤微生物活性及氮转化的影响尚鲜见报道。

目前国内外关于融雪剂对土壤环境影响的研究主要集中在土壤理化性质[2-3]和路旁植物生理生态效应[4]方面。研究表明融雪剂的使用破坏了土壤层次性，使土壤结构变差，形成片状或块状结构，造成土壤板结，土壤透水性降低[2]。在瑞典、芬兰、加拿大、美国、俄罗斯和日本等国家，由于长年使用融雪剂已引发了土壤Na+、Cl-盐分浓度急剧增加，Na+置换土壤中的Ca2+、K+和Mg2+，使土壤金属离子浓度的负对数(pM值)升高，导致土壤板结，土壤透水性大大降低[2]。氯盐型融雪剂和有机型融雪剂均可引起土壤中重金属的化学形态和迁移行为的改变，对地下水造成潜在的污染风险[5-6]。同时，化学融雪剂的大量使用会改变土壤理化性质，降低土壤中有机质和营养元素含量，从而对植被、土壤动物和微生物的生理过程和生态功能等产生影响[7]，进而导致土壤退化和环境变化。融雪剂对土壤化学性质也产生一定影响，造成土壤含水量降低，土壤容重增大，有机质含量降低，电导率增大，土壤pH值升高和阳离子交换量显著下降[3]。融雪剂的使用引发土壤盐化、酸化和钠质化，成为影响植物正常生长、降低土壤肥力、增加环境风险和影响土壤微生物活性及氮转化的重要因素。

与土壤理化性质不同，土壤生物化学性质能够灵敏地反映土壤质量的变化，土壤的微生物生物量、土壤基础呼吸作用及土壤酶活性等指标反映了土壤的生物化学性质，对环境因素的微弱变化反应敏感，能够较早地指示出土壤生态系统功能的变化，故作为土壤环境胁迫因子的预警指标能为土壤性质的变化提供可靠依据[8-10]。同时，土壤微生物参与了土壤氮循环的各个过程，既是促进土壤氮在各种形态间相互转化的动力，又能够储备、补给和中转土壤氮。因此，土壤微生物区系的活性既是土壤健康的重要表征指标，又强烈影响土壤的供给能力[11-12]。目前我国广泛使用的融雪剂是氯盐类无机融雪剂。长期使用化学融雪剂导致地表水和地下水Na+和Cl-的升高和水体密度梯度的变化[1]，对水生生物也有影响[13]。土壤是一个包含许多复杂生物化学反应的生态体，鲜有研究关注融雪剂对微生物活性及氮转化的影响及其潜在的干扰性。据此，笔者针对沈阳市主要土壤类型(棕壤)，施加不同浓度化学融雪剂开展室内模拟试验，探究化学融雪剂单一影响因素下对土壤微生物生物量碳、生物量氮、土壤呼吸作用、微生物代谢商、土壤酶活性和土壤中氮转化作用的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试土壤样品采集于辽宁省沈阳市郊区无污染、远离道路交通的农用玉米地(41°27′25.3″ N, 123°23″43.1" E)，土壤类型为多年玉米连作的典型耕地棕壤，采样深度 0～20 cm，去除土壤中杂草、石块等，放入聚乙烯塑料袋中于4 ℃冰箱保存备测。测定土壤基本理化性质为pH值6.88，含水量w为19.16%，w(总氮)为18.7 g·kg-1，主要离子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、SO42-和F-含量分别为0.02、0.06、0.13、0.02、0.02、0.46 g·kg-1和未检出。试验选用沈阳浑南新区三英科技有限公司生产的复合型融雪剂，其中主要离子K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Cl-、SO42-和F-含量分别为(11.2±2.9)、(67.8±4.3)、(68.2±2.2)、(41.3±0.2)、(395.9±2.5)、(69.3±12.9)和(10.3±0.8) g·kg-1。

1.2 试验方法与测定指标

试验设置7个处理，分别称取融雪剂0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.50 g溶于10 mL蒸馏水中，施加至过4 mm孔径筛的300 g新鲜土壤中(土壤含水量w为19.16%)，得到融雪剂处理质量浓度梯度分别为0(对照)、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%(以干重计)，每个处理浓度设置3个重复，搅拌均匀后置入1 000 mL的塑料瓶中，此时再次测定土壤含水量w为21.13%，保持此土壤湿度培养14 d后测定土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、土壤脲酶和过氧化氢酶活性[14]。微生物生物量碳采用改进的重铬酸钾滴定法，微生物生物量氮采用茚三酮比色法[15]测定。土壤呼吸测定前将土壤置于密闭塑料桶中，并放入2个装有NaOH溶液和水的烧杯以去除呼吸产生的CO2，并保持土壤湿润。培养7 d后利用Li-6400光合仪对土壤呼吸进行测定。Li- 6400仪器设置：测量深度(depth)为5 cm，样品室CO2浓度(target)为250 μmol·mol-1，CO2浓度变量(delta)为5 μmol·mol-1，测量面积(area)为80 cm2，每份土样测量10次。土壤微生物代谢熵(qCO2)为土壤基础呼吸与微生物生物量碳含量的比值。土壤脲酶测定采用苯酚-次氯酸钠比色法，以24 h后100 g土壤中NH4+-N的质量含量表示脲酶活性[15]。过氧化氢酶活性测定以30 min后1 g土壤的0.1 mol·L-1高锰酸钾的体积(mL)表示[16]。

分别模拟土壤在施用融雪剂后冬季低温(-20和4 ℃)和夏季高温(25 ℃)对土壤微生物活性和氮转化的影响。取上述已制备好的7个处理土壤10 g，向土壤中添加w为0.2%蛋白胨，搅拌均匀后置入50 mL的塑料瓶中，保持土壤湿度于25 ℃的培养箱中恒温培养，分别于第0、3、6、15、21、28天取出每个浓度梯度的3瓶土样进行分析，分别测定其中的NH4+-N和NO3--N含量。向100 g干土中加入25 mg硫酸铵，测定样品中NO3--N含量，其余操作同矿化作用。土壤NH4+-N含量采用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚蓝比色法测定[17]，土壤NO3--N含量采用双波长分光光度法测定[17]。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0软件绘图，采用SPSS 17.0软件进行线性回归分析和不同处理间差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 低温条件下化学融雪剂对土壤微生物活性的影响

试验结果表明，室内模拟冬季低温(-20和4 ℃)条件下土壤微生物生物量碳、生物量氮、土壤基础呼吸和土壤脲酶活性在不同浓度融雪剂处理间均无显著性差异(图1)。因此，该研究侧重阐述室内模拟夏季高温(25 ℃)下不同浓度化学融雪剂对土壤微生物活性和氮转化的影响。

2.2 化学融雪剂对土壤微生物生物量的影响

25 ℃条件下随化学融雪剂处理浓度的增加，土壤微生物生物量碳含量呈逐渐降低的趋势(图2)，0.1%～0.6%处理浓度比对照下降9.52%～38.10%，当处理浓度小于0.4%时生物量碳含量与对照相比无显著差异，当处理浓度大于0.5%时生物量碳含量显著下降(P<0.05)。与微生物生物量碳含量相比，生物量氮含量也随处理浓度的增加而降低，0.2%～0.6%处理浓度比对照下降2.03%～16.51%，处理浓度为0.6%时微生物氮含量与对照相比达显著水平(P<0.05)，不同浓度处理对生物量碳含量的影响大于生物量氮含量。如表1所示，微生物生物量C/N比与化学融雪剂处理浓度之间呈极显著负相关(r=-0.963，P<0.01)。

表1 各土壤生化指标与不同化学融雪剂处理浓度、土壤微生物生物量碳含量的相关性分析Table 1 Correlations for detecting indexes and deicing salts stress/soil microbe biomass C

2.3 化学融雪剂对土壤微生物基础呼吸及代谢熵的影响

图3为不同浓度融雪剂处理下土壤基础呼吸的变化。

由图3可见，随化学融雪剂处理浓度的增加，土壤基础呼吸作用呈先增加后降低的趋势。当处理浓度小于0.3%时，呼吸作用随处理浓度的增加而上升，0.2%和0.3%处理浓度下呼吸作用与对照差异达显著水平(P<0.05)，大于0.4%处理浓度呼吸作用开始下降，0.5%和0.6%处理浓度下呼吸作用与对照相比显著下降(P<0.05)。如表1所示，土壤微生物代谢熵随处理浓度的增加而增大，与处理浓度显著相关(r=0.925，P<0.05)。

2.4 化学融雪剂对土壤酶活性的影响

不同浓度化学融雪剂对土壤酶活性的影响见图4。由图4可见，脲酶活性随化学融雪剂浓度的增加而降低，0.2%～0.6%处理浓度比对照下降9.40%～45.51%，当处理浓度大于0.5%时土壤中脲酶活性与对照相比差异显著(P<0.05)。随处理浓度的增加土壤过氧化氢酶活性呈先增加后降低的趋势，仅在处理浓度为0.6%时与对照相比显著下降(P<0.05)。微生物生物量碳与脲酶活性之间呈极显著相关(r=0.946，P<0.01)。

2.5 化学融雪剂对土壤矿化作用的影响

图5为不同化学融雪剂浓度下土壤累积矿化量(NH4+-N和NO3--N含量之和)随时间的变化。培养0～6 d内各处理中蛋白胨迅速转化为矿化氮，6 d后矿化趋势减缓。当处理浓度小于0.4%时土壤矿化氮量与对照无明显差异，当处理浓度为0.5%和0.6%时土壤中矿化氮含量明显低于对照组。培养第28天0.5%和0.6%处理浓度的矿化氮含量分别是对照组的86.59%和74.35%，土壤矿化量随着化学融雪剂浓度的增加而不断降低，说明高浓度化学融雪剂对土壤氮矿化有明显的抑制作用，且化学融雪剂含量越高，抑制作用越明显。微生物生物量碳与累积矿化量具有显著正相关关系(r=0.891，P<0.05)。

2.6 化学融雪剂对土壤硝化作用的影响

图6为不同浓度化学融雪剂处理下土壤硝态氮(NO3--N)含量随培养时间的变化。

随培养时间的延长，土壤中的硝态氮含量呈明显上升趋势。随化学融雪剂处理浓度的增加土壤硝态氮含量显著下降，尤其是0.5%～0.6%处理浓度下土壤的硝化抑制作用显著。培养第28天0.1%～0.6%处理浓度比对照下降7.80%～75.19%，当处理浓度大于0.5%时对硝化的抑制与对照相比达显著水平(P<0.05)。因此，高浓度化学融雪剂对土壤中硝氮转化的抑制作用明显。微生物生物量与累积硝化量之间具有极显著相关性(r=0.942，P<0.01)。

3 讨论

土壤微生物生物量，包括生物量碳、生物量氮、生物量硫等，是土壤的重要组成部分，影响着所有进入土壤有机质的转化，是整个生态系统养分和能源循环的关键和动力，是反映土壤环境变化的敏感性指标[8,18]。

研究结果表明，随化学融雪剂处理浓度的增加，土壤微生物生物量碳和生物量氮含量下降，当处理浓度达0.5%和0.6%时生物量碳和微生物氮含量与对照相比显著下降(P<0.05)，可见高浓度融雪剂对土壤微生物生物量碳、氮抑制作用显著[14,18-20]。土壤微生物生物量C/N比是土壤群落组成的反映，土壤微生物群落由不同微生物组成，而不同的微生物生物量C/N比是不同的。细菌生物量C/N比比真菌低，因为细菌组织的蛋白质含量比真菌高[21]。土壤微生物生物量C/N比低则表明土壤微生物群落中细菌占优势[19]。随化学融雪剂浓度的增加，土壤微生物生物量C/N比降低，其与化学融雪剂处理浓度之间呈极显著负相关性(r=-0.963，P<0.01)，表明过量施用化学融雪剂会导致微生物氮胁迫增强。化学融雪剂浓度的增加可能改变土壤原有的微生物种群，导致微生物多样性降低，同时也影响了微生物种群的均匀度。KE等[22]在化学融雪剂对非根际土壤真菌和细菌种群影响的研究中指出化学融雪剂胁迫下细菌种群比真菌种群更稳定；RATH等[8]的研究也发现真菌对土壤盐渍化表现得更为敏感。盐渍化能引起细菌脂肪酸含量30%的净增加[23]，然而盐渍土中细菌占优势可能会造成复杂有机物分解困难，因为真菌对木质素和纤维素的分解有重要作用[22]。

土壤酶的专一性和综合性使其成为一个有潜力的土壤生物指标，土壤中各营养物质的循环以及养分的代谢都需要土壤酶的参与[26]。土壤脲酶是一种能将尿素水解成氨的酶，可直接参与土壤中含N有机化合物的转化，其活性在一定程度上能反映土壤的供氮能力，是与有机氮转化相关的最重要的土壤酶；过氧化氢酶可以破坏土壤生化反应过程中产生的H2O2，其活性的提高可以增强土壤氧化还原能力及好氧微生物的数量，保证土壤微生物的正常活动[9,14]。有研究指出不同浓度(2.5和5.0 kg·m-2)化学融雪剂的添加均会导致4周内土壤中大多数酶活性的降低[27]，笔者研究结果也表明化学融雪剂处理浓度的增加导致土壤脲酶和过氧化氢酶活性不同程度的下降，其对脲酶抑制程度更为明显。土壤酶主要来源于土壤微生物，土壤脲酶活性降低的原因可能是由于高浓度化学融雪剂对微生物活性的抑制以及微生物数量的减少导致微生物向土壤中分泌的土壤酶量降低；另一方面，化学融雪剂改变了土壤环境，盐分产生的渗透胁迫及离子毒害都会抑制土壤酶活性，影响了土壤酶功能的发挥[12]；此外，高盐分的土壤可使根系分泌物产生连作效应，导致土壤环境进一步恶化，酶活性降低[9]，进而抑制土壤的氮转化。

土壤氮矿化是土壤有机态氮在微生物作用下转化为无机态氮的过程，矿化产生的NH4+-N和NO3--N为土壤微生物活动及植物生长提供了主要氮来源，也是生态系统氮循环的重要环节。微生物是土壤氮转化的主体，由微生物驱动的氮转化过程包括生物固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用等，并受到生物与非生物因子(如土壤温度、湿度、盐度、有机质及微生物群落结构等)的影响[11]。有研究认为矿化作用初期适当的盐分有利于促进土壤矿化作用，盐分较高(35‰)时对土壤矿化作用具有明显的抑制作用[28]。土壤硝化作用在土壤w(Na)为100 mg·kg-1和w(Cl)为150 mg·kg-1时显著下降[29]。随化学融雪剂处理浓度的增加和培养时间的延长，土壤的矿化作用和硝化作用均受到不同程度的抑制，处理浓度高于0.5%时化学融雪剂对土壤的矿化作用和硝化作用的抑制与对照相比达显著水平。GREEN等[30]关于长期使用化学融雪剂对路域土壤中低浓度铵态氮和硝态氮的田间试验结果表明，土壤中的高Na 离子导致土壤中铵态氮含量降低。JIA等[12]的研究结果也表明，低水分处理下土壤处理盐度的增加对土壤净氮矿化和硝化过程的抑制作用越明显。累积矿化量和硝化量与微生物生物量碳含量之间呈显著正相关关系，表明化学融雪剂对矿化过程和硝化过程的抑制与土壤微生物生物量的下降有关，也有研究表明高浓度的Na离子和土壤pH值的升高抑制土壤中氨化细菌和硝化细菌的活性[30]或土壤酶活性[12]，进而导致净氮矿化速率和净硝化速率的降低。

4 结论

通过室内培养试验探明不同浓度化学融雪剂对土壤微生物生物量碳、生物量氮、土壤呼吸、微生物代谢熵、土壤脲酶和过氧化氢酶活性的影响，并进一步探究其对土壤矿化作用和硝化作用的影响。高浓度化学融雪剂(0.5%和0.6%)对土壤微生物生物量碳、氮抑制作用显著(P<0.05)。土壤中微生物生物量C/N比与化学融雪剂处理浓度之间呈极显著负相关(r=-0.963，P<0.01)，表明过量使用化学融雪剂导致微生物氮胁迫增强，土壤微生物群落中真菌数量显著减少，细菌成为优势群落。随化学融雪剂处理浓度的增加，土壤基础呼吸作用呈先上升后下降的趋势，说明低浓度化学融雪剂胁迫下微生物为了维持生存需要消耗更高的能量，表现在微生物呼吸产生的CO2增加。代谢熵和化学融雪剂处理浓度之间成显著正相关关系(r= 0.925，P<0.05)，表明随化学融雪剂处理浓度的增加，其对土壤微生物的胁迫作用越大。化学融雪剂处理浓度的增加导致土壤的脲酶和过氧化氢酶活性不同程度下降，其中对脲酶抑制程度更为明显。随化学融雪剂处理浓度的增加和培养时间的延长，土壤的矿化作用和硝化作用均受到不同程度的抑制，处理浓度高于0.5%时与对照相比达到显著水平。