良恶性肺结节CD31表达水平的影像空间异质性差异

洪俊杰，刘博乐，陈瑶，唐坤，薛蓓慧，吴孙婕，郑祥武

温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.放射科；2.病理科

影像学检查是肺结节诊断的主要手段。肺结节的及时检出，尤其是良恶性准确鉴别诊断，是肺癌早期诊断与治疗的关键[1-2]。前期研究发现良恶性结节的空间异质性差异可作为定性诊断重要依据，并推测肺结节内血供分布的差异是其病理基 础[3-5]，但目前有关肺结节近远心端空间异质性影像学特征尚缺乏病理学的依据。本研究旨在探讨良恶性肺结节CD31表达水平相关的微血管密度 （microvascular density，MVD）近远心端空间异质性差异，从而为良恶性肺结节的影像学空间异质性差异特征提供病理学依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2016年5月至2017年9月在温州医科大学附属第一医院行肺结节根治术患者的石蜡组织标本35例。所有病例均经手术和病理证实，术前均未接受过放化疗。35例中，男20例，女15例；年龄42～77岁，平均65岁；肺结节最大径1～3 cm，平均2.2 cm；其中鳞癌7例，腺癌23例，炎性结节5例。所有患者术后的肺结节标本，根据肺门与肺动脉血管走行方向，分别取其近心端与远心端两处的部分病理组织，然后用10%中性甲醛溶液固定4～ 8 h，再行常规石蜡包埋，切片厚4 μm。

1.2 研究方法 采用SP法检测所有标本CD31（武汉塞维尔生物科技有限公司）的表达水平。采用已知表达抗体做阳性对照，枸橼酸缓冲液代替一抗作为阴性对照，染色方法和步骤均按说明书进行。CD31阳性反应物为浅棕至深棕色颗粒，分布在血管内皮细胞。任何被抗体染色的单个内皮细胞或细胞团，不管是否形成管腔，只要与周围的微血管、肿瘤细胞和其他连接组织有清楚界限，都认为是一个可计数的微血管。根据Weidner校正方法[6]，在显微镜下对所有染色的切片进行微血管计数。每个切片首先在低倍镜下观察，找到切片微血管密集的区域，然后扩大至高倍镜下观察，随机选取5个视野进行微血管计数，取其平均值记为该病例近或远心端的CD31-MVD值。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS23.0软件进行分析。计量资料以±s 表示，采用配对t 检验及独立样本t 检验分析良恶性结节近心端与远心端MVD组内及组间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CD31 在所有病例中均呈阳性表达，阳性反应物为浅棕至深棕色颗粒，主要存在于血管内皮细胞，见图1。在恶性结节中，结节的近心端与远心端的MVD差异显著，近心端的MVD明显高于远心端（19.2±8.6 vs. 13.3±6.8，P ＜0.05)。在炎性结节中，近远心端的MVD差异无统计学意义（P＞0.05）。良恶性结节组间，在近心端，恶性与炎性结节之间的微血管数目差异无统计学意义（P＞0.05）；在远心端，炎性结节的MVD高于恶性结节，差异有统计学意义（28.2±10.0 vs. 26.8±3.0，P＜0.05）。

图1 CD31在良恶性肺结节中的表达（SP染色，×400）

3 讨论

肺结节的良恶性鉴别诊断一直是临床与影像关注的重点与难点。早期明确病变性质对于临床的决策至关重要。既往，在肺结节良恶性的影像学鉴别诊断中，PET以及CT增强的相关研究多数着重于结节代谢水平、强化程度、结节血供情况及其与时间的动态关系等特征，协助鉴别结节性质[7]。然而，良恶性结节的CT形态学征像及其强化特征仍有较多重叠，炎性肉芽肿类疾病也常在PET上表现出类似恶性结节的高代谢，使其鉴别肺结节良恶性的能力受限[8-9]。近年来，影像组学在医学影像学领域的应用备受关注，它通过提取感兴趣区内的高维度特征数据如纹理、组织直方图、分形维等，来定量描述病变的异质性[10-13]。研究发现，肿瘤内不均质的纹理特征一定程度上可以反映肿瘤缺氧变性及坏死、肿瘤血管生成等肿瘤生物学特性，且与肿瘤葡萄糖代谢水平及肿瘤浸润转移等分期相关，并认为该分析手段在肿瘤的定性、分级与分期等方面均具有潜在的应用价值[14-16]。然而，尚未见有直接涉及与肿瘤血供方向相关的肿瘤影像空间特征研究。2015年，我们关于孤立性肺结节的放射性活性分布的研究发现，良恶性肺结节内18F-FDG的代谢空间分布明显不同：恶性结节呈近心端高代谢，而良性结节，尤其是炎性结节趋向远心端高代谢并可作为定性诊断重要依据[3]。2017年周妮娜等[17]关于分析良恶性结节病变代谢分布差异的研究也报道了相似的结 果。2018年，我们在能谱CT中也发现了恶性结节的碘浓度水平在近心端显着高于远心端的现象，并推测其可能与良恶性结节近远心端血供差异相关[4]。

尽管如此，目前，有关肺结节近远心端异质性研究均仅有影像学观察性分析，尚缺乏相关的病理学研究佐证。为进一步分析良恶性肺结节近远心端空间异质性差异的病理机制，本研究尝试用CD31免疫组化染色来对肺结节内的微血管进行计数，并分析良恶性肺结节MVD近远心端的差异。本研究发现恶性结节近心端的MVD显著高于远心端，这一结果支持我们前期研究中关于恶性病灶代谢和碘浓度空间分布不同的结论。肿瘤是一种血管生成依赖性疾病，肿瘤的MVD与一系列肿瘤生物学行为密切相关，在肿瘤的生长和转移中起关键作用[18-19]。恶性结节与炎性结节的血供模式不同，恶性结节血供丰富，异常吻合多，血管基底膜不完整，主要由降主动脉的支气管动脉供血[7，20]。恶性肿瘤细胞由于有趋向血供的特点，在生长时会向血供丰富的方向（即近心端）发展。因此肿瘤近心端的血供更加丰富。不过，本组炎性结节较少，其近远心端的微血管数目之间并不具有显著的差异，还有待进一步加大样本验证。另外，本研究还比较了炎性结节与恶性结节组间近远心端的MVD差异，结果显示炎性结节远心端的MVD较恶性结节高，且差异具有统计学意义。本研究的创新处在于通过检测良恶性结节近远心端CD31-MVD表达水平，分析良恶性肺结节近远心端血供空间异质性特征，为影像学良恶性肺结节的空间异质性差异提供病理学依据。与影像组学通过高维度特征数据来描述肿瘤空间异质性的方法相比，本研究的优势在于更简便直观，临床易于应用。然而，本研究的不足之处在于样本量较小，尤其是炎性结节样本更少。另外，在标本处理时，对近心端与远心端的选择具有一定主观性，今后有必要进一步增加临床样本，甚或建立动物实验模型予以验证。

综上所述，本研究一定程度上表明了良恶性肺结节CD31-MVD表达水平存有近远心端空间异质性的差异，恶性结节近心端MVD高于远心端，炎性结节远心端MVD较恶性结节高，可为影像学良恶性肺结节的空间异质性差异特征提供病理学依据。