有氧运动对自发性高血压大鼠肾脏纤维化的影响

彭 朋，秦永生，王大宁，马 刚，何瑞波，刘佰川，李应森，何瑞波

心血管疾病是人类健康的头号杀手，高血压则是最常见的心血管疾病，可导致多个靶器官(心、脑、肾等)损害[1]；肾脏是最常累及的器官之一，称为高血压肾病[2]。持续血压升高通过降低入球小动脉阻力并增加出球小动脉阻力引起肾小球毛细血管压力升高(肾小球高压)，进而造成肾脏纤维化甚至肾硬化，直至肾脏完全丧失脏器功能[2]。纤维化是细胞外基质过度沉积和积聚的结果，研究证实，转化生长因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)/Smad是介导细胞外基质合成的经典信号通路，高血压肾病肾脏发生纤维化并伴随TGF-β1/Smad信号途径持续激活[3]。近年来的研究发现，高血压肾病时肾小管上皮细胞向具有细胞外基质分泌能力的肌成纤维细胞转化，即上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT)，是肾脏纤维化形成与进展的重要病理生理机制[3]。有证据显示，TGF-β1/Smad能够正向调控EMT，形成“TGF-β1/Smad-EMT-肾脏纤维化”病理过程，因此抑制TGF-β1/Smad信号通路介导的EMT是防治肾脏纤维化的重要靶点[4]。

有规律的体力活动对心血管疾病患者具有多种健康效应，其中有氧运动是主要方式[5]。有关规律运动对各种原因导致的肾脏疾病的作用鲜有关注，课题组前期的研究发现，有氧运动能够改善自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats，SHR)肾脏胶原过度沉积，其机制与减轻炎症反应有关[6]。本研究以SHR为模型，观察有氧运动对肾脏纤维化的影响并探讨肾小管EMT以及TGF-β1/Smad信号途径在其间的作用机制，为高血压肾病患者制定有针对性的运动处方提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 40只12周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠和SHR，体重(209±12)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。将10只Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压对照组(WKY)；30只雄性SHR按照随机数字表法分为高血压安静组(SHR sedentary，SHR-S)和高血压运动组(SHR exercise，SHR-E)，每组15只。动物分笼(5只/笼)标准饲料饲养，自由进食水。WKY和SHR-S组在鼠笼内安静饲养，SHR-E组进行8周跑台运动。由于拒跑(SHR-E组1只)、意外死亡(SHR-S组3只，SHR-E组1只)等原因，纳入统计的最终样本量为：WKY组(n=10)、SHR-S组(n=12)、SHR-E组(n=13)。

1.2 运动方案 所有动物先进行5 d跑台适应性训练，方案为：速度10～15 m/min，坡度0°，时间15～30 min/d。随后参照课题组前期建立的方法[6, 7]测定大鼠运动能力：起始负荷5 m/min，坡度0°，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭，记录最大跑速(maximal velocity，Vmax)。随后SHR-E组大鼠进行8周跑台运动，速度为60%Vmax对应的跑速，持续时间为60 min/次，5次/周。第2、4、6周重新测定Vmax并调整运动强度。

1.3 血压水平测定 末次训练后72 h(避免急性运动的影响)，利用无创血压测量仪(BP-2010E，日本)检测大鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)和舒张压(diastolic blood pressure，DBP)并计算平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)，测量3次取均值。

1.4 组织取材 血压水平测定后将大鼠置于代谢笼中24 h收集尿液。称重后腹腔麻醉动物，随即分离左侧肾脏，将其分为两部分，一部分用于组织病理学观察，另一部分进行分子生物学检测。

1.5 肾脏功能测定 尿样于4 ℃、3000 r/min离心15 min后取上清，利用全自动生化分析仪(AU680，美国)检测血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)含量，分光光度计(722 型，上海)测定24 h尿蛋白(urine protein，UP)含量。

1.6 肾脏病理组织学观察 取肾脏组织经4%甲醛溶液固定12 h后经脱水、包埋、制作4 μm组织切片。脱腊后进行Masson染色，中性树胶封片。倒置相差显微镜(欧林巴斯IX71，日本)下每张切片选取10个视野，观察胶原沉积情况，用图像分析软件(Image Pro Plus 6.0，美国)测量结缔组织面积与所测视野面积的比值作为肾脏纤维化指数(fibrosis index，FI)。

1.7 蛋白水平检测 利用Western blot法检测肾脏TGF-β1、磷酸化Smad2(p-Smad2)、p-Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和E-钙黏蛋白(E-cadherin，E-CA)表达量。肾脏组织匀浆后4 ℃、12 000 g离心10 min，取上清，考马斯亮蓝测定总蛋白质浓度。取100 μg蛋白样品在垂直电泳仪上经10% SDS-PAGE分离蛋白质，随后转移至PVDF膜上。兔抗鼠一抗[TGF-β1(1∶2000，Santa cruz公司)、p-Smad2(1∶1000，Abcam公司)、p-Smad3(1∶1000，Abcam公司)、α-SMA(1∶2000，Santa cruz公司)、E-CA(1∶2000，Santa cruz公司)]4 ℃静置孵育过夜，二抗(1∶5000，武汉博士德生物工程有限公司)37 ℃孵育2 h。充分洗涤后，ECL发光成像，利用凝胶成像系统(ChemiDoc XRS，美国)拍摄并扫描各条带灰度值。将各组与β-actin(1∶10000，Abcam公司)灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结 果

2.1 血压水平的变化 与WKY组比较，SHR-S组SBP、DBP和MAP均显著性升高(P<0.05)；与SHR-S组比较，SHR-E组各血压水平降低(P<0.05，表1)。

表1 三组大鼠末次有氧运动后72 h血压水平的变化

2.2 肾脏功能的变化 肾脏结构与功能检测显示，与WKY组比较，SHR-S组UP、BUN和SCr升高(P<0.05)；与SHR-S组比较，SHR-E组UP、BUN和SCr下降(P<0.05，表2)。

表2 三组大鼠末次有氧运动后72 h肾脏功能的变化

2.3 肾脏组织病理学观察与纤维化指数(fibrosis index，FI)的变化 三组大鼠末次训练后72 h肾脏组织病理变化见图1，肾实质细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。WKY组肾小球和肾小管形态结构正常，间质中仅有少量胶原纤维；SHR-S组肾小球萎缩，肾小管管腔扩张，间质增厚并存在大量胶原纤维，FI高于WKY组[(7.87±1.89)%vs.(0.43±0.05)%，P<0.05]；SHR-E组肾小球、肾小管病变减轻，胶原纤维明显减少，FI较SHR-S组降低[(3.02±0.91)%vs.(7.87±1.89)%，P<0.05]。

图1 三组大鼠末次有氧运动后72 h肾脏组织病理变化(Masson，×400)

2.4 蛋白表达量的变化 与WKY组比较，SHR-S组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表达量上调(P<0.05)，E-CA蛋白表达下调(P<0.05)；与SHR-S组比较，SHR-E组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表达下调(P<0.05)，E-CA蛋白表达上调(P<0.05，表3)。

表3 三组大鼠末次有氧运动后72 h蛋白表达量的变化

3 讨 论

临床研究证实，高血压肾病表现为细胞外基质在肾间质过度沉积，肾单位逐渐减少，肾小球滤过率和肾功能进行性下降，最终发生肾衰竭和尿毒症[2]。本研究以SHR为模型，结果发现，SHR-S组动物肾脏FI、UP、BUN和SCr均较WKY组升高，提示高血压诱导大鼠肾脏发生纤维化，肾功能降低。规律体力活动对多种原因引起的组织纤维化均具有改善效应[8]。课题组前期的研究证实，8周有氧运动可改善高血压大鼠心肌纤维化，但运动对肾脏纤维化的影响鲜有关注[7]。本研究发现，经过8周跑台运动后，SHR-E组肾脏FI、UP、BUN和SCr较WKY组显著性下降，这与以游泳运动[9]、力量训练[10]为干预方式的研究结果基本一致，说明不同运动方式均可减轻肾脏胶原沉积并改善肾脏功能，提示运动疗法作为高血压肾病的辅助治疗手段，患者应长期坚持。

TGF-β1是促进组织纤维化最重要的调控因子[11]。在受到炎性反应、氧化应激等致病因素作用后，肾脏可诱导靶细胞产生TGF-β1，与相应膜受体结合磷酸化细胞内信号分子Smad2和Smad3进而使其活化，活化(磷酸化)的Smad2/3与 Smad4结合为三聚体并进入胞核内，通过诱导促纤维化因子如结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)基因表达而刺激成纤维细胞增殖，最终导致肾脏纤维化[11]。近年来的研究指出，TGF-β1/Smad2/3信号通路介导的肾小管EMT是肾脏间质纤维化的重要病理生理机制，通常表现为细胞抗凋亡及迁移能力增强，且可大量分泌细胞外基质[12-14]。在EMT进程中，肾小管上皮细胞丧失上皮细胞黏附特性，即表皮黏附分子E-CA表达减少，同时重新表达 α-SMA等间充质细胞表型。

在本研究中，与WKY组比较，SHR-S组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表达量上调，E-CA蛋白表达量下调，说明高血压大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号通路持续激活并诱导肾小管发生EMT。临床研究证实，抑制肾小管EMT能够延缓肾脏疾病的进展并维持肾脏正常形态和功能[14, 15]。在本研究中，经过跑台训练后，与SHR-S组比较，SHR-E组TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和α-SMA蛋白表达量下调，E-CA蛋白表达量上调，提示有氧运动能够显著降低TGF-β1/Smad信号活性并抑制该信号途径诱导的肾小管EMT，因此TGF-β1/Smad-EMT可能是运动改善SHR肾脏纤维化的重要靶点。

综上所述，大鼠发生高血压时肾脏TGF-β1/Smad信号途径持续激活并诱导肾小管EMT和肾脏纤维化，肾功能进行性下降；有氧运动可能通过调控TGF-β1/Smad信号途径(下调其活性)抑制高血压肾病大鼠肾小管EMT，进而改善肾脏纤维化并提高肾功能。