工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造研究进展

李 欣， 成细瑶， 彭 飞， 陈 甜， 黄永棋， 苏正定

工业发酵教育部重点实验室和湖北省工业微生物重点实验室;湖北工业大学生物工程与食品学院，武汉 430068

甾类化合物在结构上是以环戊烷多氢菲为母核，包括三个六元环、一个五元环，和一系列不同的取代基组成。取代基的种类、构型与取代位点决定了不同甾类化合物的性质与功能[1]。自二十世纪九十年代以来，国际市场甾体类药物的销售额每年以10%-15%的速度递增，2020年全球甾体类药物销售额预计将达到1 500亿美元(http://www.chyxx.com/industry/202005/860576.html)。目前，甾体类药物是仅次于抗生素的第二大类化学药。甾体类药物的高需求促进了甾体类药物中间体的提取与制备的发展。在微生物转化植物甾醇生产甾体药物中间体的工艺技术成熟之前，以植物中薯蓣皂素作为低廉工业原料进行化学合成制备的工艺技术占据着主导地位。但随着资源的限制和环保压力，目前国际上甾体药物的主要生产方式是以微生物转化法合成起始原料，然后经过必要的化学修饰和药性改造。与传统化学法相比，微生物转化法具有周期短、收率高、专一化强、立体选择性和区域选择性好以及污染小、条件温和等优势[2]。

对能够降解甾醇的微生物的研究始于70多年前。后来，研究进一步发现属于放线菌属的微生物，如分枝杆菌、红球菌，具有降解胆固醇的能力，并具有合成新类固醇衍生物的潜力[3]。此后，其他一些细菌，如诺卡氏菌属、节杆菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、棒状杆菌属、链霉菌属、微杆菌属、沙雷菌属、无色杆菌属、假单胞菌属和鱼精胺杆菌属等，也被报道可部分或完全地降解胆固醇[4-9]。

甾醇代谢微生物的发现为甾体药物的生产提供了新的思路。1952年，美国普强药业利用黑根霉转化孕酮，将原本复杂的化学合成简化为3步且收率达到了90%[10]。随后，人们又相继发现某些菌株可以使甾体化合物在特定位点发生反应，例如新月弯孢霉可以对C11位进行羟基化[11]，亚麻刺盘孢(Colletotrichumlini)ST-1 还可以羟化黄体酮(EP)生成产物15α-OH-EP[12]。自此，微生物转化在甾体药物生产中的巨大应用潜力开始显现出来(图1)。

图1 甾体化合物生物转化位点及主要产物

目前，利用微生物开展甾体化合物转化的主要反应有母核的羟化和脱氢以及侧链的降解等。因为微生物自身含有丰富多样的酶系，所以转化反应并不总是以单一的形式发生。因此，利用一种微生物转化多种反应是可能的。例如新月弯孢霉除了可以使甾体化合物发生11β-羟基化反应，将化合物S转化为氢化可的松外，还可以使甾体化合物发生侧链降解，将黄体酮转化为雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)[13]。但是，甾体化合物最终会被微生物分解成二氧化碳和水，因此要对转化反应进行适当的控制。随着科技的发展，改造菌株的代谢途径成为了可能。本文对工业分枝杆菌植物甾醇转化途径及菌种改造的研究进展进行了综述。

1 甾醇代谢的分子机制

甾体化合物的降解是有氧代谢。早在20世纪八九十年代，研究人员就根据降解过程中产生的中间产物来研究可能的代谢途径。VAN DER GEIZE R团队发现了红球菌和分枝杆菌降解甾醇的关键基因簇，并且阐释了一些关键基因的功能[14-16]。目前，典型的分枝杆菌已经完成了全基因组测序[14, 17]。通过分析分枝杆菌基因的功能，已经初步阐明了甾醇降解反应的基本机制。甾醇降解的过程主要分为甾醇分子的摄取、母核的开环、开环甾醇的降解和侧链的氧化四个步骤。

分枝杆菌中甾体的摄取与转运影响着底物的利用水平。有研究者提出了一种灵活的多组分中间相模型(FMCM)来描述分枝杆菌对甾醇的吸收方式[18]。因为分枝杆菌的细胞外膜很厚，甾醇分子很难直接穿过。因此他们指出在分枝杆菌中应该有特定的蛋白质在甾醇的结合或转运中起作用，从而促进甾醇分子的跨膜传输。其中，胆固醇氧化酶(ChO)是一种参与甾醇摄取的界面酶，促进了甾醇的转运过程[18]。此外有研究表明，部分微生物的壁膜中含有能够对甾醇分子转运的蛋白Mce4(Mammalian cell entry 4)。例如在分枝杆菌、诺卡氏菌、红球菌和部分链霉菌中均有发现存在Mce4摄取甾醇的机制[19]。

甾醇的初步氧化是在胆固醇氧化酶和3β-羟基脱氢酶(3β-HSD)两个关键酶的作用下开启的。MycobacteriumneoaurmATCC 25795有两种ChO同工酶(ChoM1和ChoM2)。当缺失ChoM2时，菌株基本失去了氧化甾醇3β-羟基的能力[20]。但近年来，有研究小组提出在M.smegmatismc2155 和M. sp. VKM Ac-1815D等菌中普遍存在的ChoD不是甾醇氧化为甾酮的关键酶，因为ChoD失活的突变体菌株仍然保留了转化甾醇为甾酮的能力[21, 22]。3β-Hsd反应时需要NAD或NADP作为辅酶，目前发现该酶在M.tuberculosis与M.smegmatismc2155两种菌株中是氧化甾醇的关键酶[22, 23]。近期，我们在M.neoaurumHGMS2 菌种中发现，敲除ChoM1,ChoM2和HSD对胆固醇降解没有明显影响(数据发表中)。在放线菌中甾醇的侧链降解和母核氧化是相对独立的过程，甚至在同一种菌中这两个过程的顺序也是不同的[24,25]。甾醇母核氧化分为两种，分别是羟化反应和脱氢反应。其中，以羟化反应为主。细胞色素P450依赖性单加氧酶是甾醇羟化反应的关键酶，以游离或者膜结合形式存在。这种酶可以在底物分子中增加一个氧原子，另一个氧原子则用于氧化还原型辅酶Ⅰ(NADH)或还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，反应如下：RH + NADPH + O2→ ROH + NADP++ OH-[26]。3-甾酮-9α-羟化酶(KSH)也是参与母核氧化的关键酶。KSH由两部分组成，分别为末端加氧酶KshA和铁硫还原酶KshB。此外KSH还需要辅酶NADH与FAD参与反应。KSH的主要功能是催化甾体母核B环，在C9位引入羟基。3-甾酮-Δ1-脱氢酶(KstD)催化甾体分子母核A上1，2位的脱氢反应，与上述的KSH共同作用下，会引起母核B环的裂解。大多数KstD偏好4-烯-3-酮结构的底物，而KstDH37Rv最适底物是具有3-酮-(5α)-甾体结构[27]。研究者推测M.tuberculosis在降解甾体过程中与另一类3-甾酮-Δ4-(5α)-脱氢酶协同作用，经历了5α-睾酮，5α-AD，1-(5α)-AD，ADD等中间代谢物后才解体[27]。

微生物对甾醇的侧链降解反应是一类具有重要生理意义的反应，其地位仅次于甾醇的羟化。甾醇分子侧链降解的过程类似于脂肪的β氧化，反应的复杂性由侧链的长短决定。以胆固醇生成产物AD为例，过程中涉及了20多种酶的催化。研究发现，侧链降解开始于以细胞色素P450加氧酶催化C26位的末端氧化，再经过酰基CoA链接酶(FadD)催化末端酰基化，之后会进入微生物的脂肪酸β-氧化过程[28]。虽然在任何一种降解甾醇的细菌中，胆固醇的分解代谢还没有完全阐明，但可以通过结合不同物种的生化和遗传学研究来推测出较为完整的胆固醇代谢途径[29]。

2 甾醇代谢途径的基因改造

2.1 底物的摄取和转运的强化

一般认为生物接触是微生物摄取环境中的甾醇的主要方式。微生物中甾醇降解基因簇中的Mce4转运系统对甾醇的主动摄取有影响。在R.jostiiRHA1中，当Mce4部分或整体缺失时，缺陷型菌株不再利用胆固醇、β-谷甾醇等底物来生长。但是，如果以AD或者黄体酮为底物时，Mce4缺陷型菌株的生长不受影响[14, 30]。

分枝杆菌含有一层非常厚且疏水的细胞包膜，其细胞壁结构也很复杂，由peptidoglycan (PG), arabinogalactan和mycolic acids组成(图2)。因此，分枝杆菌的细胞外膜形成了一个屏障，阻止外源甾醇进入细胞，但其良好的疏水性可以溶解和存储甾醇。WEI等[31]通过对kasB这一非必需基因进行了修饰。kasB基因的缺失降低了细胞壁的紧密性，从而使细胞通透性增加，增强了甾醇的转运。对于另一种物质PG，在以往的研究中，万古霉素和甘氨酸是在革兰氏阳性菌生长过程中作用于PG生物合成的两种有效抑制剂。经万古霉素和甘氨酸处理后，增强了分枝杆菌转化胆固醇的活性。这些研究表明，PG的合成可能成为分枝杆菌基因工程改造的一个潜在靶点，通过改变细胞壁的特性来提高分枝杆菌甾醇的转化率。在分枝杆菌中，有两种特征性的B类青霉素结合蛋白(PBPA和PBPB)，它们在调节PG的生物合成从而在促进细胞分裂和形状维持方面发挥着重要的作用。SUN等[32]对pbpA和pbpB基因进行修饰，发现当两者任意一个基因失活时，细胞转化甾醇的能力降低。相反，增强pbpB基因的表达可以促进甾醇的转化。还有研究报道表明，编码海藻糖单肌酸转运体基因mmpL3的失活，使M.neoaurum中植物甾醇的消耗量增加了15.6%[33]。

图2 分枝杆菌细胞壁结构及胆固醇分解途径

2.2 母核3-位羟基氧化反应

甾醇母核反应的第一步是由ChO和3β-HSD开启的。ChOs在催化甾醇的过程中，通常结合到细胞膜表面，从细胞膜接触底物[34]。与胆固醇、植物甾醇不同，胆固酮等这类甾体化合物不会结合在细胞膜中[35]。所以，甾醇经ChO氧化后，经从细胞膜上释放出来，进入细胞质。这就意味着ChO的氧化过程可以促进分枝杆菌吸收环境中甾醇。因此，过表达产AD的分枝杆菌NwIB-R10中的ChO可以将AD的产量从1.08 g/L提高到了1.65 g/L[20]。当敲除M.neoaurmATCC 25 795中的ChOM1或者ChOM2，缺陷菌株的甾醇摄取与代谢速率都明显降低。这表明甾醇氧化为甾酮是代谢途径中关键的限速步骤，提高该步骤酶的活性可以增强甾醇吸收，进一步提高分枝杆菌的转化率。

2.3 侧链降解

来源于红球菌的酰基CoA连接酶FadD19能够催化胆固醇与胆甾-4烯-3酮的C26末端羧基产物的酯化反应。WILBRINK[36]等人的研究表明，FadD19经敲除后发现，对微生物代谢胆固醇没有影响，而β-谷甾醇的代谢明显受到抑制，表明FadD19仅能催化C24位末端羧基产物的酯化反应。最后一轮β氧化中酶的反应效率会影响C19代谢产物的产量[15]，所以对侧链降解的酶促反应研究也很重要。THOMAS等[37]敲除了基因簇中的igr操纵子，推测出催化最后一轮β氧化的脱氢、水合和硫解反应的酶，包括FadE2-29、Rv3541-42c、Ltp2。GRIFFIN等[38]采用高密度诱变和深度测序相结合的方法，对不同条件下复杂突变库的组成进行了表征，发现分枝杆菌参与侧链代谢的基因，包括ltp2、fadE29、fadE28、fadA5、fadE30、fadE32、fadE33、fadE34和hsd4B。除了将脂肪酸支链完全降解产生4-AD之外，目前还发现支链降解途径有其他的分支，例如发现了产物HBC的积累。因此对甾醇支链降解机制的深入研究是非常必要的。

2.4 母核降解机制—9,10-甾体中间体途径

除了ChO之外，KstD和KSH是母核代谢中另外两种重要的酶。然而，当这两种酶同时存在时，会导致甾体母核B环的裂解。以往的研究表明，加入抑制剂(如8-羟基喹啉)可以防止甾体母核的断裂[39]，但抑制剂对侧链降解的相关酶也会有一定的影响。另外，利用诱变技术产生突变体，也可以使甾醇不被完全降解。例如李莹等[40]通过紫外诱变与激光诱变相结合的方式处理一株产AD的分枝杆菌，结果AD的收率提高了116%，且没有ADD产生。BRZOSTEK等[41]确定KsdD-1是耻垢分枝杆菌的主要KsdD，在胆固醇降解过程中，KsdD-1的破坏导致AD或9-0H-AD的积累。WEI等[42]人对一株产AD和ADD混合物的M.neoaurumNwIB-01进行了基因改造。他们发现敲除KstD基因可以富集中间体AD；相反，强化KstD的表达则可以富集中间体ADD。从而，大大降低了后续产物分离纯化的难度。

3 讨论与展望

目前为止，通过对微生物代谢甾醇途径的关键基因进行改造，已经实现了不同甾体药物中间体的积累。但是所得到的中间体多是C19类化合物，C21以及C22类中间体的积累还需要更深入的研究。由于对甾醇侧链降解所涉及的酶没有全面的了解，目前甾醇的侧链降解反应只能在微生物的全细胞内进行，还不能实现纯酶催化。分枝杆菌细胞膜的结构复杂，尽管细胞膜缺陷的分枝杆菌细胞表现出更强的甾醇转化活性，但由于细胞生长受损，整体生产力并没有显著的提高。因此，细胞壁性质与甾醇代谢能力之间的关系还需要进一步的研究[32]。ChO与甾醇摄取运输机制的相关性一直是研究的主要内容之一。李园园等研究者[43]从分枝杆菌中鉴定相关的基因并敲除后，发现甾醇的代谢途径并不受影响，或许有其他关键基因没有并发现。因此，关于ChO在分枝杆菌摄取甾醇的过程中所起的作用仍然不是很清楚[20, 21]。虽然一些典型的分枝杆菌已经完成了全基因组测序，甾醇代谢的基本途径已经被初步推断出来，但参与甾醇代谢的相关酶系还需要更多的研究来进一步鉴定。近年来，甾体药物的微生物发酵工艺已经不断地改进，应用了很多对甾醇代谢微生物分子改造方面的成果。相信，随着微生物代谢甾醇的机制及其功能簇基因不断被揭示，微生物转化法在甾体药物的生产中将发挥越来越重要的作用。