我国部分地区乳房炎奶样中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

于 雷，邹本革，韩荣伟,石润佳，张文青，解书斌，于忠娜*

(1.青岛农业大学海都学院，山东莱阳 265200；2.青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109)

乳房炎是危害全世界奶牛的主要疾病之一。乳房炎不仅会对奶牛的健康造成极大的危害，也是养殖场经济损失的主要来源。此外，乳制品中细菌及毒素的脱落也使得乳腺炎具有严重的人畜共患病风险[1]。引起牛乳房炎感染的病原体可分为传染性和环境性病原体[2]。其中，大肠杆菌是引起奶牛乳房炎的主要环境性病原体之一[3]，也是引起毒性和致命性乳腺炎的最常见原因[4]。研究表明，大肠杆菌乳腺炎的严重性主要受患病奶牛的健康状况、泌乳阶段、胎次和遗传背景等影响[5]。由大肠杆菌引起的乳腺炎往往是急性发作，即使患病奶牛的临床症状和病菌消失，腺体在长时间内仍会受到影响，在此期间，乳品成分也会持续受到影响，从而对乳制品生产造成经济影响[6]。研究显示，奶牛乳房炎是牛场抗菌药物使用的主要原因[7]。但大部分养殖户对奶牛乳房炎病情和抗菌药物的用量不能很好掌握，奶牛场中未经控制的使用抗菌药物会增加细菌的耐药性，从而导致治疗的失败。吴利军等[8]的研究发现湖北一牛场奶牛乳房炎乳样大肠杆菌对林可霉素、青霉素、四环素和复方新诺明存在耐药性；尤从彪等[9]的研究发现甘肃省武威市凉州区乳房炎奶样中大肠埃希氏菌对氨苄西林、链霉素、四环素等的耐药性较强, 对庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素敏感；廖智慧等[10]的研究发现河北衡水地区奶牛乳房炎大肠杆菌对头孢克肟、恩诺沙星、丁胺卡那、强力霉素4种药物敏感, 对磺胺异噁唑、链霉素、阿莫西林耐药率在80%～100%之间。可见，不同地区奶牛乳房炎大肠杆菌分离株对常用抗菌药物的抗药性明显不同。因此，定期对主要病原菌进行相应药物的敏感性试验，针对不同地区不同农场选择性地使用药物，可以有效提高药物的治疗效果，从而减少牛乳中抗菌药物的残留。鉴于此，本试验无菌采集2019年7～8月份陕西、山东、新疆、北京、上海、黑龙江等六个省、市、自治区患有乳房炎的158例奶牛的奶样，对其进行大肠杆菌的分离鉴定和药敏性试验，从而指导牛场合理使用抗菌药物，提高治疗效果和畜产品质量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 奶样来源 陕西、上海、山东、新疆、北京、黑龙江等六个省、市、自治区的患有乳房炎的奶牛的奶样，共计158份。

1.1.2 主要培养基与试剂 胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)，Mueller-Hintonq琼脂(MHA)，伊红美蓝琼脂(EMB)，大肠杆菌生化鉴定管(DCSN)，Kovacs氏靛基质，甲基红指示剂，V-P试剂，购自青岛高科园海博生物技术有限公司；抗生素试纸片购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器与设备 单人双面垂直净化工作台，SW-CJ-1F，苏州智净净化设备有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅，LS-30，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；生化培养箱，SPX型，宁波东南仪器有限公司；旋涡混合器，QL-866，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 奶样来源 对患乳房炎的奶牛乳房，按常规方法消毒后收集奶样。去掉乳房出奶的前三把，无菌条件下采集15 mL，贴好标签，4 ℃保存，24 h内检测[11]。

1.2.2 大肠杆菌的分离纯化 参照文献[12]的方法进行。在超净工作台上将采集的158例奶样，取2 mL于20 mL TSB培养基，充分混匀后37 ℃恒温培养24 h，待用。用无菌接种环蘸取增菌液，在EMB培养基中四区划线后37 ℃恒温培养24 h。之后挑出在EMB培养基中呈现紫黑色或者纯紫色，并且对光观察有金属光泽的菌落，无菌挑入准备好的TSB肉汤中，放入37 ℃恒温箱培养24 h备用。

1.2.3 乳房炎奶样大肠杆菌的鉴定 无菌挑取上述菌落分别接种于蛋白胨水(色氨酸肉汤)，MR-VP(2支)和西蒙氏柠檬酸盐生化反应管。结果参照GB/T4789.38-2012 标准判定，生化鉴定结果比照表见表1。

表1 生化鉴定结果比照表

1.2.4 药敏试验 大肠杆菌的药敏试验采用纸片扩散法检测常用六类19种抗菌药物的耐药率，具体步骤参照文献[12]。用移液枪移取1.6 mL大肠杆菌菌种于20 mL无菌水的试管中，用无菌面蘸取无菌水中菌液，均匀的涂抹在MHA培养基上，再用镊子夹取药敏片呈三角状均匀的放置在MHA培养基上，每个培养基上放4个药敏片。将放好药敏片的培养基做好标记，然后在37 ℃恒温箱培养24 h，测量药敏片周围透明光环的直径并进行记录。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌鉴定结果 经分离纯化，从158例奶样中鉴定出疑似大肠杆菌57例，经生化鉴定确认大肠杆菌株38例，检出率为24.1%，具体结果见表2。

表2 大肠杆菌鉴定结果表

2.2 药敏试验

2.2.1 大肠杆菌分离菌株药敏试验 38株大肠杆菌分离株对19种药物的药敏试验见表3。同一株大肠杆菌在不同的药物作用下所表现的耐药性差异很大，从0到73.7%，其中磺胺异噁唑耐药率最高，为73.7%。大肠杆菌分离株对环丙沙星、诺氟沙星、四环素、链霉素药物的敏感率达到100%。

表3 大肠杆菌分离株药敏试验结果

2.2.2 单菌株多重耐药性分析 对38株大肠杆菌的单株耐药性分析见图1。试验结果表明，大肠杆菌分离菌株最多耐13种药物，最少耐4种药物。其中12株耐5种药物、10株耐6种药物，这些菌株均对磺胺异噁唑、头孢噻吩两种药物具有耐药性；7株耐7种药物，这些菌株均对头孢噻肟、氨苄西林、头孢噻吩和磺胺异噁唑四种药物具有耐药性。

图1 大肠杆菌分离株多重耐药情况

2.3 不同地区大肠杆菌分离株药敏试验结果 对上海、山东、北京、新疆、黑龙江五地患病奶牛奶样中大肠杆菌分离株药敏试验结果见表4。从表4可见，不同地区分离的大肠杆菌对同一种抗菌药物耐药性差异很大，头孢哌酮在上海地区耐药率为100%，在山东地区耐药率为75%，而在北京地区的敏感率为100%；头孢西丁和庆大霉素在上海地区耐药率为100%，而在其他四个地区的敏感率均为100%。

表4 不同地区大肠杆菌分离株药敏试验结果(%)

2.4 不同地区大肠杆菌分离株对六类抗生素耐药情况 上海、山东、北京、新疆、黑龙江五地患病奶牛奶样中大肠杆菌分离株对六类抗生素耐药情况见表5。从表5可见，上海和山东地区对β-内酰胺类药物的耐药情况很严重，耐药率高达75%以上；黑龙江和新疆地区对此类药物的耐药率分别为44.4%和4.0%。对于喹诺酮类药物，只有黑龙江地区对此类药物出现耐药，耐药率为1.9%，其他地区都为0。山东和黑龙江地区对四环素类药物耐药率分别为12.5%和2.8%，其他地区耐药率均为0。黑龙江地区对于磺胺类药物耐药率为52.5%，上海和新疆地区对磺胺类药物的耐药效果相同，均为50%，北京地区耐药率为33.3%。氨基糖苷类药物在上海和黑龙江耐药率分别为20.0%和1.1%，其他地区均为0。氯霉素类药物在上海和山东的耐药率为66.7%和50%，其他三省的耐药率均为0。

表5 不同地区大肠杆菌分离株对六类抗生素耐药情况(%)

3 讨 论

目前，国内外对乳房炎治疗的药物以抗菌药物为主，再加上很多农场对抗生素不科学的使用，导致大肠杆菌耐药菌株不断增多[13]，大肠杆菌的耐药性也越来越强。本试验对38株临床分离的奶牛乳房炎大肠杆菌进行了药敏试验，结果发现，分离株对19种抗菌药物产生了不同程度耐药性，不同地区分离的大肠杆菌对同一种抗菌药物敏感性差异很大。其中上海和山东地区对β-内酰胺类药物和氯霉素类药物的耐药情况比较严重，耐药率高达50%以上，因此，上海和山东地区在治疗患乳房炎奶牛应尽量避免使用β-内酰胺类药物和氯霉素类药物。黑龙江、上海和新疆地区对磺胺类药物的耐药效果均超过50%，因此，这些地区在治疗患乳房炎奶牛时不建议使用磺胺类药物，若需要使用此类药物，必须注意药物的使用剂量和要求，防止耐药率的进一步提高。本研究发现各地区大肠杆菌分离株对喹诺酮类药物、四环素类药物和氨基糖苷类药物耐药率极低，因此，在治疗奶牛大肠杆菌源乳房炎时可搭配此类药物提高疗效。大肠杆菌分离菌株最多耐13种药物，最少耐4种药物，菌株数最多的是耐5种药物。这种多重耐药性的出现可能跟不科学使用抗菌药物有关。石润佳等[11]的研究发现华北地区乳房炎奶样中大肠杆菌分离株对至少 4 种抗菌药物产生耐药性，最多耐药19种，耐药5种的菌株较多(58.82%)。

据研究报道，许多编码抗菌药物耐药性的基因位于细菌质粒上，而细菌耐药性可以通过质粒水平传播到另一株细菌，使得有些耐药菌株有可能在动物和人体内相互传播，引起危险的人类疾病，对人体的健康安全产生极大的影响，因此，也可以通过研究细菌基因内所携带的耐药基因来分析细菌的耐药性，具体可通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR、MLST等方法来实现[14]。

畜牧养殖过程中频繁使用抗菌药物会造成耐药性增强、环境污染以及畜产品中的药物残留，最终也会对人类的健康产生极大的危害[15-17]。中草药因其无抗药性、无污染、无残留等优点，可成为抗菌药物的理想替代品，在奶牛乳房炎的防治中具有广阔的发展前景，应成为未来研究的重点。开发中草药防治奶牛乳房炎，减少耐药性、药物残留等一系列问题对实现绿色健康养殖及达到国家“十二五”规划对乳品行业的要求也具有重要意义[18]。