鹅星状病毒、鹅细小病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

苗 艳，朱庆贺，陈 亮，兰世捷，冯万宇，李 丹，黄宝银，沈思思，史同瑞

(黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，黑龙江齐齐哈尔 161000)

雏鹅痛风是一种由新型鹅星状病毒(Goose astrovirus, GoAstV)引起的以内脏尿酸盐沉积为主要特征的疾病[1]，4～21日龄雏鹅易感，发病率80%左右，致死率30%～50%[2-4]。该病首次于2017年爆发，近年来在黑龙江、辽宁、江西、湖南、福建、河北、江苏、安徽、山东、河南、广东、四川等省都有爆发该病的报道，目前尚无有效疫苗可用，给养鹅业造成巨大经济损失[5-7]。鹅细小病毒病是一种由鹅细小病毒(Goose parvovirus, GPV)引起的急性、接触性、致死性疾病，以发生渗出性肠炎为主要特征，主要侵害4～20日龄雏鹅。该病传播速度快，发病率和致死率都较高，对养鹅业威胁巨大，严重限制了养鹅业的发展，目前中国、英国、瑞典等多个国家和地区都对该病进行了报道[8-10]。

GoAstV和GPV是对水禽养殖威胁严重的两种病毒，目前已有二者混合感染的报道[11-12]，因此急需一种能够快速、特异鉴别诊断这两种病毒的方法用于流行病学调查和疾病防控。目前用于检测GPV的方法有ELISA、TaqMan PCR和环介导等温PCR等[13-15]；用于检测GoAstV的方法主要是TaqMan PCR[16]。PCR检测方法较ELISA、TaqMan PCR和环介导等温PCR等检测方法具有简单、易操作、检测时间短、成本低等特点，而且也具有较高的特异性和敏感性；而双重PCR可在同一体系中同时对两种病原进行检测。因此，本研究根据GoAstV和GPV基因序列保守区域设计合成了两对特异性扩增引物，对PCR反应体系及反应条件进行优化，研究建立了一种可同时检测GoAstV和GPV的双重PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 鹅星状病毒病、鹅细小病毒病阳性病料均由实验室分离并保存。

1.1.2 主要试剂 总RNA提取试剂盒购自元亨生物技术有限公司；Taq酶、M-MLV、RNase Inhibitor购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；PMD19-T购自大连宝生物工程有限公司。

1.1.3 主要仪器 多功能基因扩增仪，FlexCycler2型，德国耶拿分析仪器股份公司；电子分析天平，ME204/02型，梅特勒-托利多(上海)有限公司；电泳仪(DYY-6D型)、紫外仪(WD-9403D型)，北京六一生物科技有限公司；双光速紫外可见分光光度计，UV-1900 PC型，上海佑科仪器仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank上已发表的GoAstV和GPV的基因序列，通过DNAStar软件比对筛选出各自序列的相对保守区域，利用Oligo7.0、primer5.0设计引物。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成，引物序列及扩增长度见表1。

表1 PCR引物设计结果

1.2.2 样品的处理和模板的制备 取GoAstV和GPV的组织病料样品放入研钵中充分研磨，向研钵中加入适量0.9%的生理盐水稀释病料，取稀释好的病料以8000 r/min离心5 min，取上清150 μL于干净的EP管中备用。GoAstV和GPV总RNA和总DNA的提取分别按照RNA提取试剂盒和DNA提取试剂盒说明书上所述方法进行，再将所提取的GoAstV总RNA按照反转录酶说明书上所述方法反转录为cDNA，-20 ℃贮存备用。

1.2.3 阳性重组质粒的制备 取所制备的模板DNA进行PCR，PCR反应体系如下(25 μL)：无菌水16.3 μL，10 × pfu buffer 2.5 μL；Taq DNA Polymerase 0.2 μL；dNTP(2.5 mmol/L)2 μL；上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL；模板DNA 2 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，47.9 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环35次；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收、纯化。将所回收的PCR产物与PMD19-T载体连接并转化至Dh5α感受态细胞中，PCR鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果显示正确的阳性重组质粒保存于-20 ℃中备用。

1.2.4 PCR反应条件的优化(引物浓度和退火温度)以所制备的GoAstV和GPV两种病毒的阳性重组质粒为模板，按照1.2.3中的PCR反应体系和反应条件进行扩增，对其中的退火温度和引物浓度进行优化，即退火温度在47～52 ℃之间选取了7个梯度进行优化，两种病毒的引物浓度组合情况见表2，其他条件不变。

表2 引物浓度优化组合

1.2.5 特异性检测 以GoAstV和GPV阳性重组质粒为标准阳性，用上述所建立的双重PCR检测方法对GPMV、GAIV、GADV和GoCV 的DNA或cDNA模板进行扩增，以检测所建立双重PCR方法的特异性。

1.2.6 敏感性检测 分别用紫外分光光度计测定GoAstV和GPV阳性重组质粒的浓度，计算模板质粒的拷贝数，将阳性重组质粒进行10倍梯度稀释，共9个梯度，即1.25×108copies～1.25×100copies。

1.2.7 临床样品的检测 共采集50份临床鹅组织样品，按照1.2.2中的方法处理样品，并提取和制备模板，用上述实验中所建立的PCR检测方法对临床样品进行检测，其中人工混合的两种病毒的阳性样品作为阳性标准品对照。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增和阳性重组质粒的鉴定 以所制备的GoAstV病毒的cDNA和GPV病毒的DNA为模板，按照1.2.3中的方法对GoAstV和GPV进行PCR扩增，结果分别特异性扩增出目的片段，大小分别为461 bp和135 bp，与预期大小一致。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。两种病毒目的片段阳性的重组质粒测序分析结果表明，成功构建了以上两种病毒的pMD19-T阳性重组质粒。

M: DL2000 Marker；1: GoAstV PCR产物；2: GPV PCR产物；3: 阴性对照

2.2 PCR反应条件的优化 当退火温度为47.9 ℃，GoAstV和GPV引物浓度分别为1.0 μmol/L和1.5 μmol/L时，各目的基因片段均能得到较好的扩增，优化产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，结果见图2和图3。

M: DL2000 Marker；1: 47.0 ℃；2: 47.3 ℃；3:47.9 ℃；4: 48.9 ℃；5: 50.1 ℃；6: 51.1 ℃；7: 51.7 ℃；8: Negative control

M: DL2000 Marker；1-8：组合1-组合8；9: 阴性对照

2.3 PCR的特异性 所建立的双重PCR检测方法能够特异性扩增GoAstV和GPV两种病毒的单一阳性样品和混合阳性样品，而对GPMV、GAIV、GADV和GoCV阳性样品均无扩增(图4)，表明所建立的双重PCR检测方法具有较好的特异性。

M: DL2000 Marker；1: GoAstV+GPV；2:GoAstV；3: GPV；4: GPMV；5: GAIV；6: GADV；7:GoCV；8: Negative control

2.4 PCR的敏感性 所建立的双重PCR检测方法对GoAstV和GPV的最低检测拷贝数分别为1.25×103copies和1.25×105copies，结果如图5所示，表明所建立的双重PCR检测方法敏感度较高。

M: DL2000 Marker；1:1.25×108copies；2: 1.25×107copies；3: 1.25×106 copies；4: 1.25×105 copies；5: 1.25×104 copies；6: 1.25×103 copies；7: 1.25×102 copies；8: 1.25×101copies；9: 1.25×100 copies；10: Negative control

2.5 PCR对临床样品的检测 对所采集的50份临床鹅组织样品进行检测，共检测出GoAstV 35份、GPV 2份，GoAstV和GPV混合感染2份，结果如表3所示，表明所建立的双重PCR检测方法能够用于GoAstV 和GPV临床样品的检测。

表3 临床样品检测结果

3 讨论与小结

GoAstV是一种2017年新出现的病毒，自发现以来已被广泛报道；GPV是一种引起水禽(鸭、鹅)高发病率和死亡率的病毒。本研究根据GoAstV和GPV在相应文献中提到的最保守基因进行设计两对特异性引物，所扩增出的条带大小相差在200 bp以上，易于区分，成功建立了一种可以同时对GoAstV和GPV进行检测的双重PCR检测方法，且特异性强、敏感性高，对GoAstV和GPV阳性重组质粒的最低检测拷贝数分别为1.25×103copies和1.25×105copies。临床样品的检测结果显示，GoAstV的检出率达70%以上，说明GoAstV的感染率较高，危害严重。所检出的两份GPV都与GoAstV呈混合感染，说明GPV和GoAstV可能常易伴发感染。由于目前样品检测数目的限制，还需进一步进行临床样品的收集和检测。本研究中所建立的双重PCR检测方法能够用于监测GoAstV和GPV在中国的流行情况，并可作为诊断这两种疾病的工具。