高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法快速筛查胡椒粉中多种农药残留

朱晓玲，刘 杰，余婷婷,*，张 莉，王会霞，吴婉琴，曹 琦，张亚珍，杨 总

（1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430070；2.上海爱博才思分析仪器贸易有限公司，上海 200335）

农药在现代农业生产过程中起着不可替代的作用，为粮食、果蔬的增产做出了重大贡献。然而农药的广泛使用伴随着日益严重的农药残留问题，农药滥用对人体健康和生态环境等方面造成了严重危害[1]。胡椒粉作为一种特殊农产品，是世界上最珍贵和最有价值的香料之一[2]。主要包括黑胡椒粉和白胡椒粉两种，其中黑胡椒粉主要是由未成熟的胡椒果实干燥加工而成，白胡椒粉主要由完全成熟的胡椒果实去皮制成[3]，既是一种很好的调味品，又是一种珍贵的药材。中国是世界上重要的胡椒生产国之一，但作为一种小众农作物品种，胡椒在我国的种植普面积遍较小，且较为分散，膳食消费量也不大，多数农药生产企业缺乏在该类产品上登记农药使用的积极性，从而造成农民无药可用或乱用药等问题[4]。尽管胡椒粉在我国的饮食结构中所占比例很小，但农药乱用的现象仍易导致该类产品出现农药残留量过高的风险，给人们带来健康隐患，同时使我国在贸易出口方面易遭遇贸易壁垒而造成经济损失，建立胡椒粉中农药残留的高通量检测方法，有利于对我国胡椒粉产业农药残留情况进行摸底，并有效促进产业的后续发展。

目前，对于农药残留高通量检测，多采用液相色谱-串联质谱法[5-9]、气相色谱-质谱法或气相色谱-串联质谱法[10-14]以及高分辨质谱法[15-18]，低分辨质谱由于受分辨率、分析速度和扫描模式的限制，无法达到农药残留高通量筛查检测和确证的要求，而高分辨质谱凭借其在质量精度、全质量数据采集、数据可溯源性和数据库检索等方面的优势，越来越多地应用于农残筛查检测领域，但研究对象多集中于水果[19-20]、蔬菜[21-24]、茶叶[25-27]以及相关的加工产品等，相应的前处理方法也较为成熟，但针对胡椒粉样品的相关检测报道较少，因此，本研究以胡椒粉为对象，采用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF MS）技术建立169 种农药的高通量多残留快速筛查方法，具有高通量、简便、快速等特点，具有一定的实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑胡椒粉、白胡椒粉 市售。

169 种农药标准品（纯度≥95%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司、农业部环境保护科研监测所；乙腈、甲醇（均为HPLC级） 德国Merck公司；甲酸、乙酸、甲酸铵（均为HPLC级） 美国Thermo Fisher Scientific公司；N-丙基乙二胺吸附剂（primary secondary amine，PSA）、十八烷基键合硅胶吸附剂（C18）、弗罗里硅土（Florisil）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）美国Supelco公司；无水硫酸钠、氯化钠（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；0.22 μm有机系滤膜天津津腾公司；超纯水（电阻率为18.2 MΩg cm，25 ℃）美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

液相色谱（Dionex Ultimate 3000）-四极杆-飞行时间质谱仪（SCIEX Triple TOF 5600+），配Analyst 1.6工作站、定性软件PeakView、MasterView、定量软件MultiQuant和数据库软件LibraryView 美国SCIEX公司；Al l e g r a X-1 5 R 型离心机 美国B e c k m a n 公司；均质器 德国IKA公司；Elmasonic P型超声波清洗器德国Elma公司；YALBOYS型涡旋混合器 上海安谱科学仪器有限公司；ME204型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

根据各农药标准品的溶解性，选择甲醇、乙腈或丙酮等溶剂配制质量浓度10 μg/mL的各农药标准储备液，-18 ℃避光保存。

分组配制混合标准中间液，根据农药化合物的性质以及单标储备液的配制溶剂，选择性挑选每10～20 种化合物为一组，以甲醇为溶剂配制混合标准中间液，169 种目标物共分为11 组，分别编号为A～K组，配制的混合标准中间液中各化合物的质量浓度为0.5 μg/mL。

吸取A～K组各混合标准中间液适量，用空白基质溶液进行稀释，配制适当质量浓度的基质混合标准系列工作液。

1.3.2 样品前处理

称取2 g（精确至0.01 g）混匀的胡椒粉样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL 2%乙酸溶液，涡旋混匀后浸泡30 min，加入15 mL乙腈，涡旋混匀，加入6 g无水硫酸镁、1.5 g无水醋酸钠，剧烈振荡1 min，4 000 r/min离心5 min。

移取4 m L 样品提取上清液置于装有净化粉末（600 mg硫酸镁、200 mg Florisil、200 mg C18）的离心管中，混匀，4 000 r/min离心3 min，上清液用水进行1∶1稀释，过0.22 μm有机滤膜，待仪器分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱： Accucore a Q C18色谱柱（2.1 mmh 100 mm，2.6 μm）；流动相：甲醇（A）和5 mmol/L甲酸铵溶液（B），梯度洗脱程序见表1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

表1 HPLC梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program for HPLC

1.3.4 TOF MS工作条件

电喷雾离子源，离子化电压：5 500 V；离子源温度：550 ℃；雾化气流量：55 L/h；气帘气流量：35 L/h；辅助气流量：55 L/h；正离子模式检测，母离子采集通道质谱扫描范围m/z100～1 000，高分辨模式，去簇电压80 V，碰撞能量10 eV。设置母离子强度大于100 cps时启动信息依赖型子离子采集，子离子采集通道质谱扫描范围为m/z50～1 000，高灵敏模式，去簇电压80 V，碰撞能量范围（35f 15）eV。质量校正液为聚丙二醇。质量偏差设置为50 mDa。

1.4 数据处理

数据库的建立采用LibraryView软件完成，数据的采集和处理采用Analyst、PeakView、MasterView软件完成。采集的样品数据在PeakView、MasterView软件中，运用建立好的数据库对HPLC-Q-TOF MS采集数据进行检索匹配分析，与数据库的保留时间、精确母离子质量数、二级质谱等相关参数进行匹配，并对阳性化合物使用MultiQuant软件进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 数据库的建立

2.1.1 一级精确质量数据库

对169 种农药化合物进行一级质谱全扫描，获得目标物的保留时间、母离子、质量偏差，以及离子化形式等信息。在LibraryView数据库软件中输入每种农药化合物的名称、分子式、相对分子质量、CAS号，建立169 种化合物的一级精确质量数据库。169 种化合物的相关信息见表2。

2.1.2 二级碎片离子数据库

设置TOF MS-IDA-Product Ion采集模式，当目标化合物的响应值超过阈值时，自动触发在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并叠加二级碎片谱图，将采集的二级图谱添加至LibraryView数据库软件中相应的化合物项下，对于二级质谱采集质量较差的化合物单独进样，设置TOF MS-Product Ion方法对目标物进行一级与二级定向采集，得到质量较好的二级碎片质谱图，并添加至谱库，由此建立169 种目标化合物的二级谱库，特征碎片离子信息见表2，可应用于样品采集数据的筛查匹配，降低出现假阳性结果的概率，提高定性结果的可信度。

表2 169 种化合物的CAS号、分子式、混合标准溶液分组以及相关的质谱信息和方法学数据Table 2 CAS numbers, molecular formulas, grouping of mixed standard solutions and mass spectral parameters and methodological data of 169 compounds

续表2

续表2

续表2

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 样品提取溶剂优化

对于农药多残留高通量检测，一般选用兼容性较好的溶剂进行提取。文献报道，乙腈相比其他溶剂具有提取效率更高、对脂肪、蛋白质、糖分等杂质的去除效果更好等优点[28]，因此，本实验选择乙腈作为提取溶剂。

同时，由于本研究基质主要为胡椒粉类干燥脱水样品，为了更有效地检测样品中农药残留的真实状况，本实验对胡椒粉样品首先进行加水浸泡，以增加样品的分散性以及样品中农药目标物的提取效率。但由于胡椒粉样品在浸泡过程中pH值较高，约为7.8，文献[29]指出，高pH值环境易导致部分碱敏感农药发生降解，水直接浸泡时，部分目标物如甲基硫菌灵、甲苯氟磺胺、氧乐果等回收率较低。因此，选择引入2%的乙酸，以对样品的pH值起缓冲作用，减少碱敏感目标物的损失。不同pH值条件下部分农药目标物的响应比较见图1。

图1 不同pH值条件下部分农药目标物的响应比较Fig.1 Comparison of response to three selected pesticide compounds under different pH conditions

2.2.2 样品净化条件优化

2.2.2.1 样品净化必要性

图2 净化前后目标化合物的峰面积变化率统计结果Fig.2 Statistical results of percentage change in peak area of target compounds before and after purification

图3 样品嘧菌酯（A）和氟菌唑（B）对比图谱Fig.3 Comparative chromatograms of azoxystrobin (A) and triflumizole (B) before and after sample purification

香辛料类样品中含有大量油脂、色素、生物碱等成分，属于复杂基质[30]，会对目标物的检测产生干扰。本实验通过对样品提取液净化前后的效果进行比较，将加标样品提取液分成两部分，一部分直接过滤膜进行仪器分析，另一部分采用QuEChERS方法净化处理后过膜分析，通过比较，发现部分目标化合物在净化前后峰面积响应变化较大，对169 种目标化合物的峰面积变化率（面积变化率/%=（净化后目标物峰面积/净化前目标物峰面积-1）h 100）计算，并对计算数据进行统计。从图2可以看出，118 种目标物净化前后峰面积变化不大，变化率为20%以内，51 种化合物净化前后峰面积变化率超过20%，其中15 种净化后峰面积响应变低，分别为异丙威、丙硫克百威、仲丁灵、醚磺隆等；36 种化合物净化后峰面积响应明显变高，分别为腈苯唑、氟吗啉、辛硫磷、抑霉唑、肟菌酯、甲咪唑烟酸等。图3列出了部分化合物净化前后的对比效果图谱，嘧菌酯、氟菌唑在不净化条件下基本不出峰。因此，净化对样品处理结果具有一定的改善，可有效降低部分化合物的检出限，且对大多数化合物没有造成较大的损失影响，因此，有必要对样品提取液进行净化处理，同时可有效避免直接进样可能会造成的色谱柱和质谱系统的污染[28]。

2.2.2.2 净化吸附剂选择及用量优化

采用QuEChERS方法进行样品净化，一般QuEChERS方法多采用PSA、C18、GCB、Florisil吸附剂粉末对样品基质中的杂质成分进行吸附，以达到样品净化的目的，但研究表明，各种吸附剂的净化效果是非选择性的，在吸附杂质的同时也会对部分农药目标物产生吸附，影响回收率。考察4 种吸附剂粉末对本研究中169 种目标物的吸附情况，结果见表3，共有72 种化合物受到吸附剂不同程度的吸附，未列于表3中的97 种化合物不受吸附剂影响，4 种吸附剂中，GCB对大多数农药目标物吸附性较强，PSA、C18和Florisil吸附剂对少量农药品种具有吸附性，PSA主要吸附甲磺隆、苄嘧磺隆、醚苯磺隆、醚磺隆等磺酰脲类除草剂以及咪唑乙烟酸、甲咪唑烟酸咪唑啉酮类除草剂；C18粉末主要吸附甲基硫菌灵、甲胺磷、敌菌灵、福美双、氯氟吡氧乙酸等化合物；Florisil主要对甲基硫菌灵、氟甲喹、甲胺磷、福美双、噻虫嗪等化合物有吸附。综合实验结果，可选择PSA、C18和Florisil对样品进行净化。胡椒粉主要成分为胡椒碱和挥发性油，有研究表明，PSA对胡椒碱和挥发性油的去除效果并不理想，PSA只能去除少量的油性化合物，如能去除韭菜提取物中约0.3%的脂肪，但不适合含有超过3%脂肪的白胡椒粉和黑胡椒粉样品[31]，因此，本研究选择C18和Florisil吸附剂对样品提取液进行净化，在兼顾并确保样品的净化效果及各目标化合物的回收率的前提下，对吸附剂的用量进行优化，最终确定每4 mL提取液加入C18吸附剂200 mg、Florisil吸附剂200 mg进行样品净化。

表3 PSA、C18、PCB、Florisil吸附剂对农药目标物的吸附情况Table 3 Adsorption efficiency of pesticide compounds by PSA, C18,PCB and Florisil

2.3 HPLC-Q-TOF MS工作条件的优化

2.3.1 HPLC流动相组成及洗脱梯度优化

比较考察甲醇-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-5 mmol/L甲酸铵、乙腈-5 mmol/L甲酸铵3 种流动相体系对目标化合物的影响。对3 种流动相体系下各农药化合物的峰面积数据以及出峰时间、峰形等信息进行综合分析，结果表明，不同流动相体系下，农药目标化合物的分离度以及质谱响应强度均存在差异，在乙腈流动相体系下，各农药目标物出峰较早，且出峰时间段密集，分离度相较于甲醇体系稍差。在质谱响应强度方面，部分农药化合物峰面积响应比较见图4，在甲醇-5 mmol/L甲酸铵体系下，各农药目标物的响应值更高，因此，选择甲醇-5 mmol/L甲酸铵作为最终流动相体系。

图4 流动相体系对部分农药化合物的峰面积响应影响Fig.4 Effects of different mobile phase systems on peak area responses of selected pesticide compounds

在HPLC流动相组成体系确定的情况下，对流动相洗脱梯度条件进行优化，比较洗脱梯度对目标物的保留及分离情况影响。根据实验结果最终选择表1中的流动相梯度，得到169 种农药目标化合物（15 ng/mL）相应的提取离子色谱图见图5，各目标化合物在3～17 min出峰，色谱峰出峰时间段分布均匀，流动相梯度设置合理。

图5 169 种农药目标物提取离子色谱图Fig.5 Ion chromatograms of mixed standard solution of 169 pesticides (15 ng/mL)

2.3.2 TOF MS工作条件优化

为了获得可靠丰富的实验数据，本研究利用仪器的信息依赖采集（information dependent acquisition，IDA）工作模式，建立TOF MS-IDA-Product Ion工作流程，在一次进样采集下，同时获得一级高分辨质谱图和二级高分辨质谱图。鉴于农药化合物均为小分子物质，因此，设定TOF MS一级全扫描质量范围为100～1 000 Da，Product Ion二级扫描质量范围为50～1 000 Da，IDA阈值设定为100 cps，当目标化合物的响应值超过阈值时，自动触发在不同碰撞能量下（20、35、50 eV）采集并叠加二级碎片谱图，同时开启仪器的动态背景扣除功能，可极大降低本底背景的二级质谱信号强度，提高样品中极低含量目标物的MS/MS信号。

2.4 基质效应

基质效应是质谱检测中普遍存在的现象[32]。实验考察黑胡椒粉和白胡椒粉的基质效应，在纯试剂和基质提取液中添加标样，比较目标物的信号峰面积，得到基质效应（基质效应=基质标样的峰面积/试剂标样的峰面积）[33]。结果显示，黑胡椒粉和白胡椒粉的基质效应趋势一致，共有131 种化合物基质效应小于0.85，存在较强的基质抑制效应；12 种化合物基质效应在0.85～1.15之间，基质效应较弱；26 种化合物基质效应大于1.15，存在基质增强效应；表明胡椒粉基质对农药检测结果存在较大的影响，因此，采用基质匹配法进行定量分析，以保证检测结果的定量准确性。

2.5 方法验证

2.5.1 标准曲线、线性范围与检出限

用空白样品提取液稀释，制备不同质量浓度的混合基质标准溶液，以峰面积（Y）为纵坐标，相应的质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，各目标化合物在5～100 ng/mL范围内，有136 种化合物线性相关系数大于0.95（其中93 种化合物的相关系数大于0.99），可进行定量分析，另外33 种化合物线性相关系数小于0.95，只能进行定性分析。

根据GB/T 27417ü 2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》，方法检出限主要是指用特定方法可靠地将分析物测定信号从特定基质背景中识别或区分出来时分析物的最低浓度或量，确定检出限的方法较多，包括目视评价法、空白标准偏差法、校准方程评估法、信噪比法等[34]。本研究采用信噪比法进行136 种定量检测目标化合物的检出限确定，在基质空白样品中添加标准溶液，以3 倍信噪比计算检出限，结果见表2。对于定性检测的33 种化合物，通过在空白样品中添加不同水平的标准溶液，每个水平分别随机检测10 次，记录检出结果的阳性率和阴性率，确定阳性检测结果具备100%可靠性时的临界值作为检出限，结果详见表2。

2.5.2 回收率和精密度

采用空白胡椒粉样品作为基质进行加标回收实验，应用1.3.2节方法进行样品前处理，以及1.3.3节和1.3.4节仪器方法进行测定，得到平均回收率为26%～140%，相对标准偏差为1.5%～36.0%。

2.6 实际样品的测定结果

采用本实验建立的HPLC-Q-TOF农药残留快速筛查技术对市售的16 批次胡椒粉样品（包含黑胡椒粉和白胡椒粉）中169 种农药残留进行测定。其中10 批次样品检出甲霜灵，为杀菌剂；8 批次样品检出啶虫脒，为杀虫剂；1 批次样品检出莠灭净，为除草剂；所检出农药的精确质量数据库匹配以及二级碎片谱库匹配，综合得分均高于90 分，实际样品中甲霜灵农药碎片离子谱图与数据库谱图镜像比对如图6所示。采用基质匹配标准曲线对筛查出的农药进行定量，所检样品中甲霜灵的最高含量为102.2 μg/kg，啶虫脒的最高含量为32.6 μg/kg，莠灭净含量为22.3 μg/kg。现行有效的GB 2763ü 2016《食品中农药最大残留限量》以及即将实施的GB 2763ü 2019《食品中农药最大残留限量》中均未对胡椒中的这3 种农药进行最高残留限量规定。

图6 胡椒粉样品中甲霜灵的碎片离子镜像信息Fig.6 Relative intensities of fragment ions in mass spectrum of phorate sulfoside in pepper powder

3 结 论

本实验建立HPLC-Q-TOF MS快速筛查胡椒粉中多种农药残留的分析方法，建立了169 种农药目标化合物的高分辨一级和二级质谱数据库，并对样品的前处理条件以及液相色谱、质谱条件进行了优化，本方法将QuEChERS前处理与高分辨质谱检测结合，可同时对样品中的目标物进行定性、定量分析，提高检测效率，该方法简便、快速、灵敏，适用于胡椒粉中农药残留高通量筛查确证分析。