不同蛋白酶对蓝蛤酶解液风味特性的影响

徐永霞，曲诗瑶，李 涛，赵洪雷，冯 媛，李学鹏，季广仁，励建荣,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；2.锦州笔架山食品有限公司，辽宁 锦州 121007）

蓝蛤（Aloididae aloidis）又名“海砂子”、“小白蛤”等，是盛产于我国沿海的一种低值海洋贝类，但由于其肉体较小，加工困难，因此其食用价值较低，除少量用于鲜食外，大部分被用作水产养殖的活饵料，造成了极大的资源浪费[1-2]。蓝蛤肉质鲜美，营养丰富，蛋白质质量分数高达60%，氨基酸组成非常全面，其氨基酸和必需氨基酸总量均高于牡蛎，和贻贝相当[3]。此外，蓝蛤蛋白中呈味氨基酸占氨基酸总量的50%以上，其中丙氨酸、甘氨酸含量均高于牡蛎、蛤蜊等贝类，是生产海鲜呈味基料的优质原料[3]。

生物酶解技术是生产天然安全调味基料的常用方法，不仅能够将原料蛋白进行充分水解，而且具有反应条件温和、能耗低、污染少，反应进程定向、可控等诸多优点，是目前低值鱼、虾类高值化利用的重要手段之一[4]。在酶解过程中，蛋白质三级结构在酶的切割下逐渐解离，构象破坏，能够生成许多易被人体吸收的游离氨基酸、短链肽等呈味物质，以及有益健康的生理活性物质如牛磺酸、活性肽及微量元素等，因此越来越受到人们的亲睐[5]。

目前，用于酶解水产蛋白的商业蛋白酶主要有中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶等。由于蛋白酶具有底物专一性，不同蛋白酶作用于肽链的位点不同，对酶解液的风味组成和营养特性也有重要影响[6]。为了制备具有较强抗氧化活性的鲈鱼蛋白肽，赵翊君等[7]采用风味蛋白酶、复合蛋白酶等5 种蛋白酶水解鲈鱼蛋白，结果发现木瓜蛋白酶酶解产物不仅具有最高的水解度和蛋白回收率，并且具有最强的抗氧化活性。钱琴莲等[8]采用电子鼻和气相色谱-质谱联用技术对7 种蛋白酶水解金枪鱼胰脏的风味进行解析，发现使用动物蛋白酶能明显增加酶解液的怡人香味，而木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶对酶解液的腥味有较好的改善作用。因此，选择合适的蛋白酶酶解，对获得风味良好、营养价值高的酶解液具有重要影响。鉴于此，本实验以蓝蛤为研究对象，采用复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶进行单酶酶解，通过电子鼻、电子舌、固相微萃取-气相色谱-质谱联用及氨基酸自动分析仪等对不同蛋白酶酶解液的风味差异进行对比分析，旨在为蓝蛤的酶解及深加工利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活蓝蛤购于辽宁省锦州市林西路水产市场。蓝蛤吐沙后速冻，在冷冻状态下去壳取肉，备用。

复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶（均为食品级） 广西南宁庞博酶制剂有限公司；邻苯二甲醛、甲醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；PEN3便携式电子鼻系统 德国Airsense公司；SA-402B型电子舌 日本Nikon公司；DK-8D型高速冷冻离心机 上海一恒科技有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取纤维头、20 mL顶空样品瓶美国Supelco公司；DF-101S型集热式磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；MS105DU型精密电子天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪 瑞典FOSS公司；UV-2550紫外光谱仪日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解液的制备

准确称取蓝蛤肉30 g，加入90 mL蒸馏水，充分混匀后于90 ℃水浴锅灭酶15 min，冷却至40 ℃后调节至相应蛋白酶的最适pH值范围，然后分别加入0.3%的复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶，充分混匀并在其最适温度下酶解8 h。待酶解结束后灭酶，冷却至室温后于5 000 r/min离心10 min，取上清液，备用。

1.3.2 水解度测定

采用邻苯二甲醛法进行测定[9]。准确称取2 g酶解液，去离子水定容至100 mL后，吸取400 μL样品于离心管中，加入3 mL邻苯二甲醛溶液混匀，反应2 min后于340 nm波长处测定其吸光度。采用凯氏定氮法测定蓝蛤肉中总氮含量。蛋白质水解度计算公式如下：

1.3.3 电子鼻测定

准确量取5 mL酶解液样品于50 mL烧杯中，保鲜膜密封，室温静置30 min后进行电子鼻检测。电子鼻分析参数：测定时间100 s，顶空温度25 ℃，内部流量300 mL/min，进样流量300 mL/min，每个样品重复测定3 次。PEN3电子鼻传感器及其性能描述见表1。

表1 电子鼻传感器及其响应物质Table 1 Electronic nose sensors and their performance descriptions

1.3.4 固相微萃取-气相色谱-质谱联用分析

固相微萃取条件：准确量取8 mL酶解液于顶空瓶中，加入1.44 g氯化钠及磁转子后迅速加盖密封，于磁力搅拌器中60 ℃加热平衡15 min，用活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附40 min，然后将萃取头插入气相色谱进样口，解吸5 min。

气相色谱条件：H P-5 M S 毛细管柱（3 0 m h 0.25 mm，0.25 μm）；氦气流速1.0 mL/min；不分流模式进样；程序升温：柱初温40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至100 ℃，再以5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：色谱-质谱接口温度280 ℃，离子源温度230 ℃；离子化方式：电子电离，电子能量70 eV；质量扫描范围m/z30～550。

1.3.5 电子舌测定

分别取35 mL各组酶解液样品于电子舌专用样品杯中，按照设置的序列放置在电子舌自动进样器上进行检测，单次采样时间为120 s，1 次/s。每组样品重复检测4 次，取后3 次传感器信号趋于稳定即每根传感器第120秒响应值进行味觉特征分析。测量前对电子舌进行自检、活化、校准和诊断等步骤，以确保采集所得数据的可靠性和稳定性。

1.3.6 游离氨基酸测定

取1 mL酶解液，于12 000 r/min离心10 min，取上清液800 μL，过20 μm滤膜，加入到色谱瓶中，然后采用氨基酸自动分析仪进行测定。

1.3.7 滋味活性值（taste active value，TAV）的计算

TAV指某一呈味物质的浓度与其阈值的比值[10]。根据TAV的大小，可以判断该物质对样品整体滋味的贡献，TAV小于1表示该物质对呈味无贡献，而TAV大于1表示该物质对呈味有贡献，且数值越大，认为该物质对呈味贡献越大。

1.4 数据分析

酶解液中挥发性成分采用NIST 11/Wiley 7.0谱库进行定性分析。采用Origin 9.0绘图，采用SPSS 19.0进行数据处理及显著性检验，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 水解度分析

图1 蛋白酶对蓝蛤酶解液水解度的影响Fig.1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of A.aloidi muscle hydrolysate

蓝蛤酶解液的风味与水解度以及酶种类有关。由图1 可知，不同蛋白酶酶解液的水解度差异显著（P＜0.05），其中复合蛋白酶的水解度最大，达到28.02%；其次是碱性蛋白酶和中性蛋白酶，水解度分别为21.86%和19.83%。复合蛋白酶是由内切蛋白酶、外切肽酶以及风味蛋白酶复合而成的，具有较多的切割位点，因此使得蓝蛤蛋白水解更为彻底，水解度最大。碱性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶，能够切割芳香族或疏水性氨基酸残基的肽键，其选择性相对风味蛋白酶低[11]；中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌发酵提取的一种内切酶，具有严格的切割位点，从而使其水解位点相对局限。木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的水解度较低，分别为15.50%和14.41%，这2 种蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶，也称为巯基蛋白酶，可作用于肽链中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并对N-端具有2 个羧基的氨基酸具有优先水解性[12-13]。

2.2 电子鼻分析

为研究不同蛋白酶对酶解液气味的影响，采用电子鼻对其整体气味轮廓差异进行分析。由图2可以看出，电子鼻的R2、R6、R8和R9等传感器有明显的响应，说明氮氧化合物、烷烃类、醇类、芳香成分和有机硫化物等物质可代表蓝蛤酶解产物的气味轮廓[14]，并且复合蛋白酶组的响应值更大。为进一步分析不同蛋白酶酶解液气味的差异，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法对电子鼻气味指纹数据进行分析。由图3可知，PCA中PC1、PC2的贡献率分别为64.90%、27.96%，两者之和为92.86%，超过了85%，说明PC1和PC2几乎包含了蓝蛤酶解液中气味的整体信息。由图2可以看出，各组样品的数据点分布比较集中，表明电子鼻检测的重复性较好，数据稳定、可靠；各组样品之间没有重叠部分，说明电子鼻的PCA能有效区分不同蛋白酶酶解液的气味差异。此外，复合蛋白酶组样品在PC2上的响应值明显高于其他4 组样品，可能是由于复合蛋白酶酶解较为彻底，从而使其气味差异更为明显。

图2 蓝蛤酶解液电子鼻雷达图Fig.2 Radar diagram of electronic nose responses to A.aloidi muscle hydrolysates

图3 蓝蛤酶解液电子鼻PCAFig.3 PCA plot of electronic nose responses to A.aloidi muscle hydrolysates

2.3 气相色谱-质谱联用分析

如表2所示，复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶酶解液中分别检出39、28、30、35 种和34 种挥发性物质，主要包括醛类、酮类、醇类和烃类等物质，其中复合蛋白酶酶解液中挥发性物质总数最多，木瓜蛋白酶组中最少。

醛类和醇类是蓝蛤酶解液中检出种类数最多、含量也最丰富的挥发性物质。5 种酶酶解液中共检出12 种醛类物质，占总挥发性物质的22.47%～50.7%，其中碱性蛋白酶酶解液中醛类物质相对含量最大。不同酶解液中均检出的醛类有己醛、(E)-2-己烯醛、庚醛、苯甲醛、苯乙醛、壬醛等。醛类物质一般来源于氨基酸的Strecker降解反应或脂肪的氧化降解，其中C6～C9的饱和醛和不饱和醛具有清香、果香和脂香味，且阈值很低，对蓝蛤酶解液的整体气味特征具有重要贡献[15]。己醛、庚醛和壬醛等具有青草气味、油脂气味和鱼腥味[16]，其在碱性蛋白酶组中相对含量最高，在复合蛋白酶组中最低。(E,Z)-2,6-壬二烯醛等是产生鱼腥味的主要化合物，在碱性蛋白酶组中相对含量最高，在复合和木瓜蛋白酶组中未检出。苯甲醛具有强烈的坚果香和腥味[17]，在碱性蛋白酶组中相对含量最高，在复合蛋白酶和中性蛋白酶组中较低。醇类物质一般具有独特的清香、果香、花香和甜味等令人愉悦的风味，其中不饱和醇的阈值相对较低，可能对蓝蛤酶解液风味的形成具有一定的作用[18]。实验中共检出12 种醇类化合物，其中中性蛋白酶组中检出的醇类物质相对含量最大，碱性蛋白酶组中最低。不同酶解液中均检出的醇类有1-戊醇、庚醇、1-辛烯-3-醇和2-乙基己醇。1-辛烯-3-醇具有典型的蘑菇和泥土气味，可增强酶解液的脂肪香味[19]。2-乙基己醇具有淡花香和甜味，在不同酶解液中均检出且含量较高，可能对酶解液的风味有一定影响。此外，在木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和中性蛋白酶酶解液中检出芳樟醇，该物质具有似铃兰的花香和甜香，可能对酶解液的腥味有一定的改善作用。

不同酶解液中共检出8 种酮类，其中复合蛋白酶酶解液中检出的酮类物质种类最多、含量最高，其次是碱性蛋白酶组。(E,E)-3,5-辛二烯-2-酮具有水果香，仅在复合蛋白酶酶解液中检出，该物质的存在可能对酶解液的风味产生较好影响。2-壬酮具有水果香和花香，在复合蛋白酶酶解液中检出的含量较大。蓝蛤在酶解过程中，随着蛋白质结构的解离，其中的脂肪逐渐发生氧化并生成醛、酮等羰基类和醇类等物质。不同酶解液中检出的羰基类、醇类物质含量的差异可能与其水解度有关，蓝蛤蛋白水解程度越大，肌肉组织结构破坏越严重，脂类物质和氧气接触的表面积也就越大，从而增加了其脂肪氧化程度。

烃类物质主要来源于脂肪酸的氧化降解，由于其阈值较高，对蓝蛤酶解液的整体风味贡献可能不大[20]。实验中共检出8 种烃类物质，其中复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解液中检出的烃类物质相对含量较高，可能与其较高的水解度有关。蓝蛤酶解液中检出了2 种呋喃类物质，其中复合蛋白酶酶解液中相对含量最高。呋喃是一类重要的风味化合物，主要来源于脂肪的氧化、氨基酸的降解及美拉德反应等，通常具有很强的肉香味，对酶解液有一定的增香作用[20]。2-乙基呋喃具有强烈的肉香、焦香和甜味，在5 种酶解液中均检出；2-戊基呋喃具有类似火腿的香味。蓝蛤酶解液中还检出了少量的酯类、酸类和苯酚等物质，酯类包括乙酸乙酯和乙酸丁酯，酯类通常具有甜的果香和清香气味，酯类和酮类物质共存时可能对酶解液的整体风味有协调和平衡的作用[8]。

表2 不同酶解液的挥发性成分组成Table 2 Volatile compound composition in different protease hydrolysates of A.aloidi muscle

2.4 电子舌分析

图4 蓝蛤酶解液电子舌雷达图Fig.4 Radar diagram of electronic tongue responses to A.aloidi muscle hydrolysates

图5 蓝蛤酶解液电子舌PCAFig.5 PCA plot of electronic tongue responses to A.aloidi muscle hydrolysates

电子舌是近年来快速发展的一种分析检测液体滋味的新型手段，它能够模拟人的舌头对样品的酸味、苦味、咸味、鲜味、涩味、回味和丰富度等进行评价[21]。由图4可以看出，不同蛋白酶酶解产物主要呈现鲜味、丰富度（鲜味回味）和苦味，其中碱性蛋白酶酶解液中鲜味和丰富度的响应值较高，而酸味响应值较低，这可能与其酶解过程中的pH值有关，碱性环境能够减缓酶解液的酸味感。不同蛋白酶酶解产物的苦味响应值差异较小。由图5可知，PC1和PC2贡献率分别为76.9%和17.8%，累计贡献率达到94.7%，表明PC1、PC2可以充分反映样品的整体滋味信息，电子舌PCA能有效区分不同蛋白酶酶解液。不同蛋白酶酶解液之间分布分散，说明各组样品之间的滋味存在差异。其中复合蛋白酶和中性蛋白酶酶解液分布相对较近，表明这2 组酶解液的滋味相似度比较高[22]；而碱性蛋白酶酶解液与其他4 组酶解液相距较远，说明其滋味差异较大。

2.5 游离氨基酸分析

氨基酸组成及含量对酶解液的呈味特性具有非常重要的影响[23]。由于不同蛋白酶酶切位点的差异，因此其酶解产物中氨基酸组成也会不同。由表3可知，5 种蛋白酶酶解液中共检出17 种游离氨基酸，不同蛋白酶酶解液中游离氨基酸的总量存在较大差异，含量由高到低依次为复合蛋白酶＞碱性蛋白酶＞中性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞菠萝蛋白酶。复合蛋白酶组中游离氨基酸总量较其他蛋白酶组差异显著（P＜0.05），由于复合蛋白酶的水解度最大，因此酶解过程中释放出大量的游离氨基酸，而菠萝蛋白酶水解度小，释放的游离氨基酸总量也低。

表3 蓝蛤酶解液中游离氨基酸组成Table 3 Free amino acid composition of A.aloidi muscle hydrolysates

氨基酸不同的结构特性主要使其呈现出鲜味、甜味和苦味等类型，呈味氨基酸含量高可增加酶解液的浓厚感、丰富度[24]。从呈味氨基酸组成看，鲜味、甜味氨基酸所占百分比含量最高的是碱性蛋白酶，苦味氨基酸所占百分比含量最高的是复合蛋白酶。谷氨酸和天冬氨酸在碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶组中含量较高，这2 种氨基酸具类似味精的味道，使得酶解液具有鲜美可口的味道[25]。甜味氨基酸中的甘氨酸、丙氨酸在蓝蛤酶解液中检出的含量较高，其中甘氨酸除了赋予甜味以外，还可以降低酶解液的苦味，改善产品品质[26]。丙氨酸和谷氨酸等呈味氨基酸共存时，可产生协同增效作用，为鱼类、肉类等提供强烈的鲜味感[27]。呈苦味的氨基酸种类繁多，5 种酶解液苦味氨基酸中亮氨酸含量最高，此外，复合蛋白酶酶解液中检出较多的精氨酸，而其他蛋白酶组中检出很少或未检出。Lioe等[28]研究发现当苦味氨基酸含量低于呈味阈值时，可增强其他氨基酸的鲜味和甜味。

2.6 呈味物质的TAV分析

蓝蛤酶解液的滋味强度受呈味物质的含量和阈值共同影响[29]。蓝蛤酶解液中游离氨基酸的阈值及TAV如表4所示，虽然不同蛋白酶酶解液中Asp的TAV均小于1，但是Glu的TAV均大于1，说明蓝蛤酶解液具有较强的鲜味。其中碱性蛋白酶组中Glu的TAV最大，中性蛋白酶次之，木瓜蛋白酶最小。不同蛋白酶酶解液中Ala的TAV均大于1，说明蓝蛤酶解液具有一定的甜味，其中碱性蛋白酶组Ala的TAV最大。鲜味和甜味物质在整体呈味物质TAV中占比大于50%，其中碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和中性蛋白酶均大于80%，这表明鲜味和甜味是蓝蛤酶解液的主要呈味成分。中性蛋白酶组中Met的TAV大于1，复合蛋白酶组中Arg、Met和Val 3 种苦味氨基酸的TAV均大于1，说明复合蛋白酶组的苦味较强。虽然木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶中苦味氨基酸的TAV均小于1，但它们可以增强蓝蛤酶解液中其他氨基酸的鲜味和甜味[28]。

表4 蓝蛤酶解液呈味物质的滋味特征、阈值和TAVTable 4 Taste attributes, taste thresholds and TAVs of taste-active compounds in A.aloidi muscle hydrolysates

3 结 论

本实验研究了复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶对蓝蛤酶解液风味的影响。结果表明，复合蛋白酶的水解度达到28.02%；电子鼻和电子舌分析发现不同蛋白酶酶解液的挥发性成分和口感存在较大差异；对呈味游离氨基酸组成分析发现，鲜味和甜味是蓝蛤酶解液的主要呈味成分，复合蛋白酶组中游离氨基酸总量最高，碱性蛋白酶组中鲜味和甜味氨基酸比例最大；复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶以及中性蛋白酶组中分别检出39、28、30、35 种和34 种挥发性物质，其中醛类和醇类物质种类和含量最丰富，己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛和(E,Z)-2,6-壬二烯醛等具有腥味的物质在碱性蛋白酶组中相对含量最高，而在复合蛋白酶和中性蛋白酶组中含量较低，中性蛋白酶组中醇类含量最高，2-乙基呋喃和2-戊基呋喃等增香的物质在复合蛋白酶组中相对含量较高。因此，复合蛋白酶的水解度最大，且酶解液的整体风味良好。