Haloperidol可以增敏索拉非尼诱导的肝癌细胞铁死亡

马凤娇，田国亮，郭高生，陈 雷

0 引言

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一种常见的高发病率、高死亡率的癌症类型[1]。晚期肝癌患者的手术和非手术治疗都不能取得令人满意的结果，目前开发的针对肝癌患者的靶向药物也只有索拉非尼(Sorafenib)和雷戈拉非尼(Regorafenib)能够成功延长肝癌患者的生存时间[2-3]。索拉非尼是首批用于晚期肝癌患者全身治疗的靶向药物[2-3]，随后的研究也证实了索拉非尼在临床应用中的有效性[4]。

目前的研究认为，索拉非尼是细胞铁死亡(Ferroptosis)的特异性诱导剂[5-6]。铁死亡是一种不同于细胞凋亡、坏死和自噬的依赖于脂质过氧化程度增加的细胞死亡方式[7]。细胞铁死亡的发生机制如下：①细胞内铁的聚集；②谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的耗竭以及下游蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4，GPX4)的失活；③铁死亡抑制蛋白1(Ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)和辅酶Q10的相互作用。以上途径都会导致细胞内脂质活性氧(Lipid Reactive oxygen species,Lipid ROS)含量的增加，进而导致铁死亡的进程。Fer-1是铁死亡的特异性抑制剂，能够有效降低细胞内的Lipid ROS含量，抑制铁死亡的发生[8-12]。

Haloperidol是一种σ-1受体(Sigma-1 receptor，S1R)拮抗剂。S1R是一种非阿片样蛋白，在中枢神经系统、肝脏、胰腺和癌细胞都有广泛表达[13]。最近的研究发现，S1R可能通过激活抗氧化相关因子并减少氧化的GSH和谷氨酸来减少ROS的产生[14-15]。也有研究发现，S1R通过调节NRF2-Keap1途径和胱氨酸/谷氨酸反向转运系统xCT(Cystine/glutamate antiporter,xCT)来调节Lipid ROS含量，进而在铁死亡中发挥作用[13]。

在这项研究中，我们发现S1R拮抗剂haloperidol可以通过调节GSH和GPX4，进而增强索拉非尼对肝癌细胞的抗癌作用。我们的研究进一步确认了S1R和细胞铁死亡之间的的联系，为肝癌的治疗提供了一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及材料 精密电子天平(Sartorius 德国)；Eppendorf 离心机(Eppendorf公司,德国)；振荡涡旋器(科尔德实验仪器厂,中国)；双向磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司,中国)；pH计(MeterToledoGmbH公司,德国)；细胞培养皿(Corning,美国)；PCR八连排(Axygen,美国)；Olympus BX60显微镜(奥林巴斯公司 日本)；恒温CO2培养箱(Heraeus type B 5060 EK/CO2,美国)；超净工作台(北京市昌平长城空气净化设备公司生产,中国)；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司,中国)；微量加样器(Eppendorf公司,德国)；NANODROP 1000分光光度计(Thermo SCIENTIFI,美国)；冰箱(青岛海尔公司,中国)；Mx3000PTM 实时定量PCR仪(Stratagene公司,美国)；恒温水浴箱(上海快进医疗器械厂,中国)；医用微波炉(广东美的集团,中国)；通用电源(Bio-rad,美国)。GPX4(ab125066,Abcam公司)；S1R(sc137075,Santa Cruz公司)；sorafenib(No.S7397,Selleck公司)；Fer-1(No.S7243,Selleck公司)；haloperidol(No.S7743,Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞株和引物 肝癌细胞株HepG2，Huh-7，SMMC-7721和PLC/PRF/5细胞购自中国科学院(中国上海)。这些细胞培养于添加了10%胎牛血清(HyClone)以及100 U / ml青霉素和链霉素的DMEM培养液(HepG2，Huh-7和PLC/PRF/ 5)或RPMI 1640培养基(SMMC-7721)中。生工生物技术公司(上海)合成引物，见表1。

表1 合成物引物

1.2.2 RT-qPCR分析 用TRIzol试剂进行总RNA(Invitrogen)提取。利用反转录试剂盒(TOYOBO)进行cDNA合成，按照说明书进行qPCR实验(TaKaRa)。反应条件如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共40个循环。反应结束后根据(2-ΔΔCT)计算每对样本的相对表达量。

1.2.3 Western-blot分析 用RIPA试剂(碧云天)进行蛋白提取。采用BCA法蛋白质浓度的测定。利用10%的SDS-PAGE进行凝胶电泳，150 mA湿转90 min，利用5%脱脂牛奶室温封闭60 min。一抗4℃孵育过夜，1XTBST洗3次后，二抗室温孵育1 h，1XTBST再次洗膜。最后，用ECL 化学发光液(Invitrogen)对蛋白条带进行观察，在Image J上对条带进行分析。

1.2.4 细胞增殖实验 利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法进行细胞活性分析。96孔板中加入104细胞悬液，细胞贴壁后按照实验设计进行给药处理，处理24 h后加入CCK-8染料。用酶标仪在520 nm处进行吸光值测量。

1.2.5 克隆形成实验 利用结晶紫染色进行细胞活性分析。按照实验设计进行给药处理细胞24 h，经胰蛋白酶消化后，以低细胞密度接种，温育1～3 周，固定染色并计集落数。

1.2.6 GSH含量测定 使用GSH分析试剂盒(索莱宝)对细胞内GSH的含量进行测量。离心收集细胞，加入RIPA裂解液收集蛋白上清置冰上待测，按照说明书依次加入试剂进行反应，最后用酶标仪在412 nm处进行吸光值测量。

1.3 统计学处理 GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，根据资料类型，计量资料采用单因素方差分析，P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 索非拉尼诱导肝癌细胞发生铁死亡 为了确认索非拉尼对肝癌细胞的影响，我们构建了索非拉尼诱导肝癌细胞发生铁死亡的体外模型。首先，向肝癌细胞HepG2(图1A)，Huh-7(图1B)，SMMC-7721(图1C)和PLC/PRF/5(图1D)细胞中添加不同浓度的索非拉尼处理24 h，利用CCK-8实验对细胞活性进行检测。结果显示，与DMSO组相比，不同浓度的索非拉尼都能显著降低肝癌细胞的活性，并且随着索非拉尼浓度的增加，细胞的活性逐渐降低；由于5 μM索非拉尼在这四种细胞株中都能显著降低细胞活性并且具有统计学意义(图1A-D;P<0.001)，所以后续实验选用5 μM索非拉尼进行。为了进一步验证索非拉尼诱导的细胞死亡是铁死亡，向培养基中同时添加5 μM索非拉尼以及铁死亡的特异性抑制剂Fer-1，Fer-1能够有效抑制索非拉尼诱导的肝癌细胞死亡(图1A-D;P<0.001)。这些结果表明，索非拉尼能够诱导肝癌细胞发生铁死亡，进而降低其活性。

图1 索非拉尼诱导肝癌细胞发生铁死亡注：(A-D)索非拉尼处理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC/ PRF/5(D)细胞24 h，利用CCK-8法进行细胞活性分析。数据表示为平均值±标准差，***P<0.001 vs. DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼

2.2 索非拉尼诱导S1R表达 向肝癌细胞HepG2(图2A)，Huh-7(图2B)，SMMC-7721(图2C)和PLC/PRF/5(图2D)细胞中添加不同浓度的索非拉尼处理24 h，利用RT-qPCR实验及Western-blot实验对S1R的变化进行检测。结果显示，与DMSO组相比，不同浓度的索非拉尼都能显著增加肝癌细胞中S1R的mRNA水平，并且随着索非拉尼浓度的增加，细胞S1R的mRNA水平逐渐增加(图2A-D;P<0.001)；同时，Western-blot实验也发现，细胞内S1R水平也能被索非拉尼提高(图2E;P<0.001)。这些结果表明,索非拉尼诱导肝癌细胞发生铁死亡后，细胞内存在保护性升高的S1R水平。

图2 索非拉尼诱导S1R表达注：(A-D)索非拉尼处理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC / PRF / 5(D)细胞24 h，利用RT-qPCR实验对S1R的mRNA水平进行检测。(E)索非拉尼处理HepG2细胞24 h，利用Western-blot实验对S1R的蛋白水平进行检测 数据表示为平均值±标准差，***P<0.001 vs.DMSO

2.3 Haloperidol可以促进索拉非尼诱导的肝癌细胞铁死亡 向肝癌细胞HepG2(图3A)、Huh-7(图3B)、SMMC-7721(图3C)和PLC/PRF/5(图3D)细胞中同时添加索非拉尼和S1R的拮抗剂haloperidol处理24 h，利用CCK-8实验对细胞活性进行检测。结果显示，与索非拉尼组相比，索非拉尼+haloperidol组的肝癌细胞的活性进一步降低并且差异具有统计学意义(图3A-D，P<0.001)；并且同时添加索非拉尼和haloperidol导致的肝癌细胞死亡也能够被铁死亡的特异性抑制剂Fer-1抑制(图3A-D，P<0.001)，这表明haloperidol促进肝癌细胞的铁死亡进程。克隆形成实验也发现，索非拉尼+haloperidol组的肝癌细胞克隆数比单独添加索非拉尼组更低(图3E，P<0.001)。

图3 Haloperidol可以增敏索拉非尼诱导的肝癌细胞铁死亡注：(A-D)索非拉尼和haloperidol处理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC/PRF/5(D)细胞24 h，利用CCK-8法进行细胞活性分析。(E)索非拉尼和haloperidol处理HepG2细胞24 h，利用克隆形成实验进行细胞活性分析。数据表示为平均值±标准差，***P<0.001 vs.DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼

2.4 Haloperidol可以降低铁死亡进程中的GSH及GPX4 同时添加索非拉尼和haloperidol处理肝癌细胞24 h，利用GSH含量测定实验以及Western-blot实验对细胞内的GSH含量及GPX4水平进行检测。结果显示，与索非拉尼组相比，索非拉尼+haloperidol组HepG2(图4A)、Huh-7(图4B)、SMMC-7721(图4C)和PLC/PRF/5(图4D)细胞中GSH含量进一步降低并且差异具有统计学意义(图4A-D，P<0.001)；并且同时添加索非拉尼和haloperidol也会导致GPX4蛋白水平的进一步降低(图4E，P<0.001)。

图4 Haloperidol可以降低铁死亡进程中的GSH及GPX4注：(A-D)索非拉尼和haloperidol处理HepG2(A)，Huh-7(B)，SMMC-7721(C)和PLC / PRF / 5(D)细胞24 h，利用GSH试剂盒对细胞内GSH的含量进行检测。(E)索非拉尼和haloperidol处理HepG2细胞24 h，利用Western-blot实验试剂盒对细胞内GPX4的蛋白水平进行检测。数据表示为平均值±标准差，***P<0.001 vs.DMSO，## P<0.01；###P<0.001 vs.5 μM索非拉尼。

3 讨论

索拉非尼是一种新型多靶向性的治疗肿瘤的口服药物,能选择性地靶向某些在肿瘤生长过程中发挥作用的受体。索拉非尼是铁死亡的诱导剂之一，之前的研究发现索拉非尼诱导的铁死亡不受细胞内致癌基因状态的影响[16]，它能够直接结合GPX4并使其失活，而不会影响GSH的水平[17]。目前的大部分研究都发现,GPX4是铁死亡进程中的核心靶点[9,18]。

目前大部分研究都通过调节细胞内脂质活性氧的积累和铁代谢来调节细胞铁死亡进程。同时，稳定细胞内GSH浓度也可保护细胞免受脂质过氧化反应的影响进而抑制铁死亡进程。本研究中，我们发现S1R是人类肝癌细胞中铁死亡的负向调节剂，它可以调节铁死亡中关键分子的表达，如GSH 以及GPX4等。

Haloperidol是一种治疗精神/情绪障碍的S1R拮抗剂，之前关于S1R的研究主要集中在中枢神经系统[19-24]。在癌细胞中，索拉非尼可以诱导S1R蛋白表达，从而保护细胞免于ROS的积累和随后的肥大症。因此，S1R可能在肝细胞癌中起双重作用。一方面，S1R保持自由基和氧化应激的稳定环境，进而阻止了肝细胞癌的发生。另一方面，索拉非尼可以上调S1R，以保护癌细胞免于肥大症。我们的研究发现，haloperidol处理后，GSH及GPX4表达进一步降低，这明S1R可能是GSH及GPX4的上游调控因子。我们在后续实验中也会对S1R和GSH及GPX4之间的具体机制进行进一步探讨。利用S1R拮抗剂haloperi-dol可以加快索拉非尼导致肝癌细胞铁死亡的进程。

在这项研究中，我们首次证明haloperidol可以加快索拉非尼诱导的肝癌细胞铁死亡进程。haloperidol通过抑制S1R调节GSH及GPX4的表达,从而提高索拉非尼的抗癌作用。因此，更好地了解S1R的作用会为铁死亡的生化机制提供新的见解。我们后续也会进行进一步的实验来探索S1R和GSH及GPX4之间的具体作用机制。