miR-21和miR-146a在癫痫患者中的表达及临床意义

黄忠，曾义，王曦，赵戈

癫痫是神经内科较为常见的中枢神经系统疾病，其发病率近年来呈逐步上升趋势，以脑部神经元放电异常所致的短暂且反复的神经中枢功能失常为主要临床特征[1]。癫痫发作对患者的身体和精神均会造成严重影响，癫痫长期和反复发作容易对中枢神经造成损伤，具有一定致残率和病死率，给患者的日常生活造成严重负担[2]。引起癫痫的病因较为复杂，如遗传因素、脑部疾病和系统性疾病均可能引起癫痫发生，目前缺乏有效的临床治疗手段[3]。研究显示，在癫痫发作过程中部分微小RNA(miRNA，miR)表达异常，可以作为癫痫诊断和预后预测的生物学标志物[4]。miR是一类长度为20～24个碱基的短链RNA，不编码蛋白质，在体内广泛分布，参与细胞增殖、分裂和分化等一系列生物学过程[5]。miR-21与中枢神经系统疾病的发病密切相关，参与脑部炎性反应，其表达量升高会促进缺血性脑卒中和神经损伤的发生[6-7]。miR-146a同样参与中枢神经系统的发病过程，与星形胶质细胞发育异常相关，参与唐氏综合征和阿尔茨海默症的发病过程[8-9]。 现分析癫痫患者血清miR-21和miR-146a表达水平及其临床意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年4月—2019年5月成都中医药大学附属第五人民医院/成都市第五人民医院神经内科诊治的癫痫患者99例作为癫痫组，选择同期医院健康体检者99例作为健康对照组。健康对照组男51例，女48例，年龄24～68(48.25±16.73)岁；体质量指数(BMI)18.8～22.9(21.42±1.32) kg/m2。癫痫组男55例，女44例，年龄25～70(50.14±18.26)岁；病程1～12(6.74±1.96)年；BMI 18.5～22.1(20.77±1.08)kg/m2；癫痫类型：单纯部分性癫痫发作45例，复杂部分性癫痫发作21例，继发性癫痫全面发作33例；癫痫严重程度量表(NHS3)[10]评分11～21(16.05±4.46)分；吸烟史48例，酗酒史39例；高血压史49例，糖尿病史22例，高脂血症史5例，冠心病史1例。2组性别、年龄及BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会审核，受试者及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 病例选择标准 (1)纳入标准：①符合2017年国际抗癫痫联盟制定的癫痫发作诊断标准[11]：有>2次非诱发性或非反射性癫痫发作，且间隔>24 h；患者已发生1次非诱发性或非反射性癫痫发作，且患者在未来10年内癫痫复发风险与2次非诱发性或非反射性癫痫发作后复发风险相当，符合以上任意1条即可确诊；②经脑电图及头部CT和MR检查诊断；③年龄>18岁；④入院前6个月内未接受过相应抗炎治疗。(2)排除标准：①合并肿瘤患者；②存在脑部手术史者；③存在全身性感染性疾病；④存在自身免疫性疾病；⑤存在药物依赖性疾病；⑥存在精神障碍性疾病。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 血清miR-21和miR-146a表达量检测：采用荧光定量PCR仪(美国ABI科技有限公司生产，型号：ABI5800)检测。患者入院翌日晨/健康对照组体检当日采集空腹肘静脉血5 ml，高速离心机(湖南湘仪科技有限公司生产，型号：H1650)5 000 r/min离心30 min后吸取上清液待检测，离心半径12.5 cm。采用mirVana miRNA分离试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司生产)提取血清miRNA，使用miRNA cDNA合成试剂盒(美国赛默飞世尔科技有限公司)对提取获得的miRNA进行逆转录，逆转录体系：miRNA 5 μl，反转录缓冲液5 μl，10×miRNA反转录引物2 μl，水8 μl。反转录条件：37 ℃、60 min，95 ℃、5 min。使用mirVana qRT-PCR miRNA检测试剂盒对cDNA进行定量检测，反应体系25 μl，包括水16.5 μl，5×PCR buffer 5 μl，50×ROX溶液0.5 μl，DNA聚合酶1 μl，PCR上游引物1 μl，PCR下游引物1 μl。反应条件：95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，进行35个循环。miR-21上游引物序列：5’-TGCGCTAACAGTCTACAGCCA-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。 miR-146a上游引物序列：5’-TGCGCTGAGAACTGAATTACCAT-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，以U6基因作为内参基因，U6上游引物序列：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物序列：5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’。根据2-△△Ct法计算miR-21和miR-146a的相对表达量。

1.3.2 血清TNF-α和IL-6水平检测：使用TNF-α检测试剂盒(上海晶抗生物工程有限公司生产)及IL-6检测试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司生产)，以酶联免疫吸附法检测血清TNF-α和IL-6水平，实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1 各组血清miR-21、miR-146a表达和炎性因子水平比较 癫痫组血清miR-21、miR-146a表达水平和血清TNF-α、IL-6水平明显高于健康对照组(P均<0.01)，见表1。

表1 2组受试者血清miR-21、miR-146a表达水平和炎性因子水平比较

2.2 血清miR-21、miR-146a表达与血清TNF-α、IL-6水平及NHS3评分相关性分析 血清miR-21与NHS3评分表达呈高度正相关(P<0.01)，而与IL-6和TNF-α呈中度正相关(P<0.01)。血清miR-146a与血清TNF-α和NHS3评分均呈中度正相关(均P<0.01)，而与IL-6呈弱正相关(P<0.01)，见表2。

表2 血清miR-21和miR-146a表达与血清TNF-α和IL-6水平及NHS3评分相关性分析

2.3 血清miR-21和miR-146a表达水平诊断癫痫价值分析 采用ROC曲线下面积(AUC)评估血清miR-21、miR-146a及二者联合诊断癫痫的价值，结果显示，miR-21、miR-146a及二者联合诊断癫痫的AUC分别为0.760、0.793、0.884，见表3、图1。

3 讨 论

神经元放电活动异常与基因遗传、免疫系统紊乱和病毒性感染等因素相关，神经元的放电异常是导致癫痫发作的主要因素[12]。对于年龄在35岁以上的中枢神经系统病变患者癫痫发病率明显升高，为普通人群的3～5倍[13]。临床研究显示，目前的癫痫治疗临床有效率低于45%，并且停止治疗后有较高的复发率，严重影响患者的日常生活。传统的临床诊断方式往往更依赖医生的个人经验，且癫痫的症状与晕厥有着高度相似性，不易区分，血清miR的检测具有可重复性强、周期较短、不过于依赖个人经验的优点，因此对癫痫发作过程中涉及到的相关基因表达变化进行系统研究有助于癫痫的治疗和诊断，为癫痫的靶向治疗及诊断提供新的生物标志物靶点及诊疗策略[14]。

图1 血清miR-21和miR-146a诊断癫痫的ROC曲线

在肿瘤发病及心脑血管疾病发生过程中miRNA均起到重要的调节作用，miRNA通过与基因的信使RNA(mRNA)结合促进mRNA降解，使得基因转录水平下降，进而影响基因的翻译，引起基因编码蛋白质水平的下降，影响相应信号通路的活化，导致疾病的发生[15]。癫痫发病过程中能够观察到患者星形胶质细胞体积增大，胞浆肥大，细胞核缩小并且偏位，星形胶质细胞存在发育异常[16]。在生理状态下，星形胶质细胞能够分泌神经因子至胞外，作用于神经元并对神经元具有一定的保护作用。而在病理条件下，星形胶质细胞之间产生较强的缝隙连接，并形成相应的星形胶质细胞网络。缝隙连接的增强会促进神经元的同步化放电，而同步化放电是造成惊厥的生理基础，因此缝隙连接的增强会导致癫痫发作[17]。本研究发现，癫痫患者血清miR-21水平明显升高，其原因可能是由于miR-21在星形胶质细胞分化成熟过程中起到一定抑制作用，已有研究报道显示，miR-21会抑制星形胶质细胞的分化，导致星形胶质细胞的功能异常，并且miR-21能够活化信号转导与转录激活因子3(signal transduction and transcriptional activator 3, STAT3)信号通路以增强磷脂酰肌醇聚糖6蛋白的表达，进而促进急性缺血性脊髓损伤的发生。磷脂酰肌醇聚糖6蛋白参与缝隙连接的形成，其表达水平的升高会促进神经元之间缝隙连接的产生，从而促进神经元同步化放电[18]。miR-146a则是由星形胶质细胞产生的一类miRNA，Sison等[19]发现在病理条件下，星形胶质细胞产生的过量miR-146a会下调神经元的数量，进而导致脊髓型肌萎缩的发生。由于癫痫患者中普遍能够观察到发育异常的星形胶质细胞分泌大量miR-146a至胞外，从而导致血清miR-146a水平升高。

表3 血清miR-21和miR-146a表达水平诊断癫痫的ROC 分析

本研究探讨血清miR-21和miR-146a与癫痫发病之间的关系，结果显示，癫痫患者体内存在一定程度的炎性反应，并且伴随炎性反应的发生血清miR-21和miR-146a也随之升高。进一步研究发现癫痫患者血清miR-21和miR-146a的升高与炎性反应发生之间存在联系，并且与癫痫病情严重程度存在相关性。癫痫发作与炎性反应联系密切，脑部炎性反应的产生会导致脑部生理环境及局部微环境发生紊乱，内环境中神经递质、神经因子、细胞因子水平紊乱会造成神经元放电异常，导致癫痫发生。miR-21与炎性反应的联系在既往研究中并不少见，Xue等[20]研究发现，在脓毒性休克患者血清中miR-21水平明显升高，并且miR-21参与炎性小体的形成和激活。Venugopal等[21]的研究表明，miR-21是NF-κB炎性反应信号通路的下游靶基因，核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号通路活化在引起TNF-α和IL-6等炎性因子水平升高的同时会上调miR-21表达。癫痫发作过程中炎性反应水平升高并且炎性相关信号通路活化，使TNF-α和IL-6等炎性因子水平及miR-21升高，miR-21表达水平升高促进炎性小体的形成，从而对炎性反应起到正反馈调节的作用，使炎性反应的强度和范围逐步扩大，加剧癫痫患者病情。miR-146a同样参与炎性反应过程，如Sun等[22]研究表明，基质细胞衍生因子受体(cxc chemokin receptor 4,CXCR4)基因是miR-146a的靶基因，miR-146a作用于CXCR4 mRNA的3’端并促进其降解，导致CXCR4蛋白表达水平升高。而CXCR4是十分重要的炎性反应抑制分子，miR-146a下调CXCR4蛋白表达会导致炎性反应加剧。同时，Chen等[23]研究发现，病毒感染会促进miR-146a的产生及NF-κB信号通路活化，NF-κB信号通路活化促进IL-8、CC趋化因子配体5(CC chemokine ligand 5,CCL5)和干扰素β(interferon β,IFN-β)等炎性因子的释放，导致炎性因子水平升高。miR-146a与NF-κB信号通路之间存在正反馈调节，miR-146a水平升高促进NF-κB信号通路的活化，使得炎性反应进一步加剧。因此在癫痫患者体内，一方面炎性反应的发生会上调miR-146a水平，另一方面，miR-146a表达量上调会促进NF-κB信号通路的活化，进一步加剧炎性反应，导致癫痫患者病情加重[24]。

ROC曲线结果还显示，血清miR-21和miR-146a联合检测的敏感度和特异度明显高于各指标单独检测，分析其原因可能是由于血清miR-21和miR-146a单独检测具有一定的漏检率，二者联合检测能够有效降低漏检率，从而提高检测的敏感度和特异度，并且研究结果提示血清miR-21和miR-146a联合检测可以作为癫痫发作的辅助标志物。

综上所述，癫痫患者血清miR-21和miR-146a水平及炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，血清miR-21、miR-146a与炎性因子TNF-α、IL-6水平及NHS3评分均呈正相关，在癫痫患者的诊断中具有一定临床价值。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

黄忠：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；曾义：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改;王曦：进行统计学分析；赵戈：提出研究思路，分析试验数据，论文审核