miR-132在上皮性卵巢癌中的表达及作用机制研究

杨波，李胜泽，郭苏阳，马珊珊，张庆松，李玉芝

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性癌症中最常见的一种，是导致女性癌症死亡的第五大常见原因[1]。全世界每年有约23万名妇女被确诊，其中15万人最终病死，诊断5年后存活率约46%[2]，严重威胁女性生命安全。筛查和诊断困难、化疗耐药性及较高复发和转移性是EOC高病死率的主要因素[3]。因此，寻找卵巢癌新型治疗手段或治疗靶标，降低患者病死率成为目前研究的热点。沙敏等[4]研究发现，微小RNA-132(miR-132)可靶向调节高尔基体糖蛋白73抑制肝癌的发生、发展和转移。miR-132可靶向性别决定区Y-box 4 蛋白抑制肺癌细胞在体外的迁移和侵袭[5]。推测miR-132可能与肿瘤细胞迁移、侵袭过程有关[6]。以往研究发现，miR-132在卵巢癌组织和细胞中低表达，且过表达miR-132可抑制卵巢癌细胞增殖，促进其凋亡[7]，但其与卵巢癌复发转移的关系尚不清楚。因此本研究通过检测miR-132在人卵巢癌组织和细胞中表达水平，并以miR-132相对表达水平较低的卵巢癌SKOV3细胞为研究对象，观察过表达miR-132对卵巢癌SKOV3细胞侵袭、迁移的影响，并进一步探讨可能的作用机制，以期为寻找有效生物靶标治疗卵巢癌提供一定理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)组织标本和细胞系: 收集2018年10月—2020年2月蚌埠医学院第一附属医院妇瘤科手术切除的卵巢癌及癌旁非肿瘤组织标本36份，均经病理诊断确诊，置于-80℃保存。术前均未进行放疗或化疗。人正常卵巢上皮细胞(IOSE80，购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司)、卵巢癌SKOV3细胞(购自上海瑞鹿生物技术有限公司)。(2)试药及试剂：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物及miR-132慢病毒构建及包装均由上海吉玛生物公司设计合成；qRT-PCR试剂盒购自美国ThermoFisher公司；反转录试剂盒购自美国Fermentas公司；Trizol试剂购自美国Sigma公司；荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；荧光素酶报告载体由上汉恒生物公司提供；小鼠抗人单克隆丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；兔抗人基质金属蛋白酶-2(MMP-2)多克隆抗体、兔抗人MMP-9多克隆抗体、兔抗人GAPDH多克隆抗体均购自美国abcam公司；辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG二抗购自北京中杉金桥公司。(3)仪器设备：电泳仪购自美国Bio-Rad公司，qRT-PCR仪购自美国ABI公司，酶标仪购自奥地利CliniBio公司，凝胶成像仪购自南京创睿仪器仪表有限公司。

1.2.1 实时荧光定量PCR检测卵巢癌组织中miR-132相对表达水平：从卵巢癌病理组织切下约100 mg置于研钵中加入液氮研磨至细粉，移至装有1 ml的Trizol离心管中，提取总RNA，根据引物合成软件Premier 6.0设计引物序列，见表1，用反转录试剂盒对RNA合成cDNA。按照实时荧光定量PCR试剂盒说明书配20 μl反应体系，反应条件：95℃预变性15 min、95℃变性10 s、56℃退火20 s、72℃延伸50 s，40个循环，以U6为对照，采用2-△△Ct法分析miR-132相对表达水平。

表1 miR-132、U6的qRT-PCR引物序列

1.2.2 细胞转染及细胞分组：选取miR-132相对表达水平最低的卵巢癌SKOV3细胞和正常卵巢上皮细胞(IOSE80)于37℃，5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞密度为1×106/ml，每孔200 μl接种于24孔板，正常卵巢上皮细胞(IOSE80)为正常对照组，卵巢癌SKOV3细胞分为空白对照组、LV-NC(阴性对照)组和LV-miR-132 mimic(模拟物)组，每组8个复孔，取2支EP管分别加入200 μl完全培养基备用，管中分别加入24 μl浓度为1×108TU/ml慢病毒和慢病毒空载体(转染复数MOI值为60)，均匀混合后各加入4 μl浓度为6 μg/ml 聚凝胺备用；将EP管中的慢病毒空载体和慢病毒液加入LV-NC组和LV-miR-132 mimic，空白对照组加入PBS 28 μl，置培养箱培养12 h后，更换新鲜完全培养基继续培养。

1.2.3 qRT-PCR检测各组细胞中miR-132、MAPK1 mRNA相对表达水平：应用Trizol从上述各组细胞中提取总RNA，以qRT-PCR方法检测各组细胞中miR-132、MAPK1相对表达水平，MAPK1以GAPDH为对照，其中MAPK1和GAPDH引物序列见表2。

表2 MAPK1、GAPDH的qRT-PCR引物序列

1.2.4 Transwell法检测卵巢癌SKOV3细胞的侵袭率：上述转染细胞48 h后，常规消化离心，调整细胞密度为2.5×105/ml，取200 μl加入Transwell小室的上室中，24孔板下室加入完全培养基 500 μl，培养12 h后，弃培养基，擦拭Matrigel和上室残留细胞，置于新的24孔板中，4%多聚甲醛室温固定30 min，弃固定液，0.2%结晶紫染色10 min，PBS清洗，风干后在倒置显微镜下随机选取5个视野观察并记录穿膜细胞数(着色为紫色)。侵袭率=实验组穿膜细胞平均数/对照组穿膜细胞平均数×100%。

1.2.5 细胞划痕实验检测卵巢癌SKOV3细胞的迁移率：上述转染细胞48 h后，行各组细胞消化、离心后调整密度为2.5×105个/ml，每孔2 ml接种于六孔板中，第2天用无菌500 μl枪头垂直孔板背后的横线，制造细胞划痕，确保每个孔内划痕宽度一致，PBS清洗3次，洗去划下的细胞，12、24、48 h取样拍照，对各组细胞分析，细胞迁移率=(0 h划痕区域宽度-拍照时间划痕区域宽度)/0 h划痕区域宽度×100%。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测卵巢癌SKOV3细胞与MAPK1的靶向关系：分别构建含有MAPK1的野生型和突变型3′-UTR序列的荧光素酶报告基因质粒(MAPK1-Wt和MAPK1-Mut)。收集卵巢癌SKOV3细胞，调整细胞密度为2×105/孔，接种于24孔板中，miR-132 mimic或NC分别与MAPK1-Wt质粒和MAPK1-Mut质粒共同转染至卵巢癌SKOV3细胞，每组8个复孔，继续培养48 h。按照荧光素酶活性检测试剂盒操作说明对荧光素酶活性进行测定。

1.2.7 Western-blot检测卵巢癌SKOV3细胞中MAPK1、迁移与侵袭相关蛋白表达： 上述细胞转染72 h，分别收集各组细胞，PBS清洗，加入含PMSF的RIPA裂解液在冰水浴中处理，提取蛋白，BCA法测定各组蛋白的浓度，加入蛋白上样缓冲液(体积为蛋白样品液的4倍)，沸水浴加热3～5 min，放于-20℃保存。按照SDS-PAGE凝胶配方表制备10%分离胶和5%浓缩胶，以每泳道30 μg蛋白上样，蛋白凝胶电泳，根据蛋白marker切胶，转膜，对抗体MAPK1、MMP-9、MMP-2、GAPDH均按照1∶500的比例稀释后4℃孵育过夜，放摇床1.5 h，TBST清洗，加入辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG二抗，室温孵育并放摇床2 h，TBST清洗后，参考ECL发光液说明书对条带孵育、曝光、显影。Image J对条带灰度值分析。

ATB混合料碾压应遵循“紧跟慢压、高频低幅”原则，压路机应紧跟摊铺机后进行碾压，避免混合料热量散失过多，初压使用13T双钢轮振动压路机静压2遍；复压采用13T振动压路机振动碾压3～4遍，碾压温度控制为100～110℃；终压使用11T钢轮压路机静压2～3遍以消除轮印，碾压温度不低于80℃。

2 结 果

2.1 卵巢癌组织与癌旁组织中miR-132相对表达水平比较 癌旁组织miR-132相对表达水平为(1.02±0.12)，高于卵巢癌组织的(0.50±0.11)，差异有统计学意义(t/P=19.166/0.000)。

2.2 各组细胞miR-132、MAPK1 mRNA相对表达水平比较 与正常对照组比较，空白对照组miR-132相对表达水平显著降低，MAPK1 mRNA相对表达水平显著升高(P<0.05)；与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-132 mimic组miR-132相对表达水平显著升高，MAPK1 mRNA相对表达水平显著降低(P<0.05)；而空白对照组与LV-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 各组细胞中miR-132、MAPK1 mRNA相对表达水平比较

2.3 各组SKOV3细胞侵袭能力比较 与空白对照组细胞侵袭率(81.00±8.20)%、LV-NC组(73.56±7.77)%比较，LV-miR-132 mimic组(38.86±6.86)%显著降低，差异有统计学意义(F/P=19.166/0.000)，而空白对照组、LV-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 各组SKOV3细胞侵袭能力比较 (结晶紫染色，×200)

2.4 各组SKOV3细胞迁移能力比较 与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-132 mimic组细胞迁移率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白对照组、LV-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2、表4。

图2 各组卵巢癌SKOV3细胞迁移率比较

表4 各组卵巢癌SKOV3细胞迁移率比较

2.5 各组SKOV3细胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平比较 与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-132 mimic组细胞MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平均显著降低(P<0.05)，而空白对照组、LV-NC组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3、表5。

图3 各组细胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白免疫印迹图

表5 各组细胞中MAPK1、MMP-2、MMP-9蛋白表达比较

2.6 miR-132与MAPK1的靶向关系 应用microrna.org数据库预测MAPK1 3′-UTR与miR-132存在结合位点。而与miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR组比较，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR组荧光素酶相对活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-132 NC+MAPK1-Mut 3′-UTR组、miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR组荧光素酶相对活性比较差异无统计学意义(P>0.05)；与miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR组比较，miR-132 mimic+MAPK1-Mut 3′-UTR组荧光素酶相对活性显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 双荧光素酶报告实验验证miR-132与MAPK1靶向关系

3 讨 论

卵巢癌是女性中仅次于乳腺癌、肠癌、肺癌和子宫内膜癌的第五大常见癌症，是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因之一[8]。卵巢恶性肿瘤中上皮性卵巢癌约占85%。由于其表现隐蔽，往往直到晚期才被诊断，导致高病死率。在过去20年中，发病率和病死率一直相当稳定，尽管近年在外科手术治疗方面已取得较大进展，但由于多数患者确诊时已发展至晚期，导致较高的病死率[9]。因此寻找预测卵巢癌分子标志物并对其生物学功能进行深入研究，将有助于提高卵巢癌诊断和治疗水平，具有重要的临床意义。

微小RNAs(microRNA，miRNAs)是一种小的非编码RNA分子[10]，它可调节多种基因的表达，目前，已知的人类miRNAs有1 000多个，控制着50%以上哺乳动物蛋白质编码基因，miRNAs表达异常与不同疾病发生发展的关系，已成为近年研究热点。miRNAs可通过靶向关键蛋白编码基因，参与卵巢癌发生、发展和转移，如miR-628-5p可通过靶向下调成纤维细胞生长因子受体2的表达，诱导卵巢癌细胞凋亡，显著抑制肿瘤生长并降低其致瘤性[11]；miR-338-3p通过靶向Runx2显著抑制卵巢癌细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡[12]。miR-132存在于人类染色体17p13，与中枢神经系统、肿瘤、炎性反应、和血管生长密切相关[13]，但其对上皮性卵巢癌的增殖、凋亡、侵袭转移能力的影响目前还未有明确阐述。本研究结果显示，卵巢癌组织中miR-132相对表达水平较癌旁组织显著降低，卵巢癌SKOV3细胞中miR-132相对表达水平较正常卵巢上皮细胞(IOSE80)显著降低，表明miR-132在卵巢癌组织和癌细胞中表达下调，与以往研究一致[7]，表明其在卵巢癌的发生发展中可能起到重要的调控作用。本研究进一步采用慢病毒转染构建miR-132过表达卵巢癌SKOV3细胞，结果显示，与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-132 mimic组细胞中miR-132相对表达水平显著升高，提示miR-132过表达SKOV3细胞系建立成功。

由于卵巢癌细胞的侵袭性生长特征，使得肿瘤完全切除存在较大困难，肿瘤易出现复发和转移，导致患者病死率较高[14-15]，因而抑制癌细胞侵袭转移是卵巢癌的重要治疗方向。本研究通过Transwell法及细胞划痕实验检测miR-132对卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移能力的影响，结果显示，SKOV3细胞经LV-miR-132 mimic慢病毒转染后，其侵袭率、迁移率均显著降低，表明miR-132可调控卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移过程，上调其表达可显著抑制卵巢癌侵袭、转移。研究表明，肿瘤细胞在侵袭、转移过程中，可离开原发灶，透过基底膜进入血管，继而移出血管或淋巴管形成微小转移灶，再进一步增殖进而形成转移肿瘤。细胞外基质是肿瘤细胞转移的第一道屏障，肿瘤细胞可通过产生蛋白水解酶降解细胞外基质，其中MMP-2、MMP-9可降解细胞外基质，并分解Ⅳ型胶原蛋白，增强肿瘤细胞的运动性和黏附能力，在肿瘤细胞侵袭和迁移过程中具有重要作用[16]。本研究结果显示，与空白对照组、LV-NC组比较，LV-miR-132 mimic组细胞MMP-2、MMP-9蛋白相对表达水平均显著降低，表明miR-132过表达可下调MMP-2、MMP-9蛋白表达，抑制卵巢癌SKOV3细胞侵袭和迁移。

MAPK1属于MAPK激酶家族，可通过激活MAPK信号通路，促进MMP-13、含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-4(ADAMTS-4)等细胞外基质分解代谢因子表达，抑制Ⅱ型胶原等合成代谢蛋白表达，导致细胞外基质受损，与肿瘤细胞转移有关[17-19]。近年研究发现，MAPK1在不同类型的癌症中表达异常，Flum等[20]研究发现，miR-217-5p可靶向MAPK1抑制大肠癌细胞迁移和侵袭，诱导细胞凋亡。研究表明miR-508通过靶向MAPK1抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭[21]。Li[22]等研究发现，miR-329-3p过表达可靶向抑制MAPK1从而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，He等[23]研究发现，miR-132-3P靶向抑制MAPK1抑制大肠癌发生发展。另有研究表明，miR-132过表达可调控ERK1/2对NP细胞外基质的降解作用[24]。本研究发现，卵巢癌SKOV3细胞中MAPK1 mRNA相对表达水平较正常卵巢上皮细胞显著升高，以LV-miR-132 mimic慢病毒转染SKOV3细胞后，其细胞中MAPK1 mRNA和蛋白相对表达水平均降低，表明MAPK1在卵巢癌SKOV3细胞中表达上调，miR-132可下调MAPK1表达，推测miR-132可能通过靶向下调MAPK1表达来抑制卵巢癌细胞迁移、侵袭。本研究基于TargetScan、microRNA.org、miRbase数据库预测发现，miR-132与MAPK1存在结合位点，进一步采用双荧光素酶报告实验验证发现，miR-132 mimic+MAPK1-Wt 3′-UTR组的荧光素酶相对活性低于miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR组，而将MAPK1 3′突变后，其荧光素酶相对活性与miR-132 NC+MAPK1-Wt 3′-UTR组相比无明显变化，表明miR-132能够直接靶向下调MAPK1的表达，进而影响MMP-2、MMP-9蛋白表达，降低卵巢癌细胞迁移侵袭能力。

综上所述，上调miR-132可能通过靶向MAPK1抑制卵巢癌细胞迁移、侵袭，为阐述卵巢癌发生发展机制、识别和鉴定肿瘤标志物、开展肿瘤靶向治疗提供了新理论依据。本研究的不足之处在于没有敲除或沉默miR-132以进一步验证miR-132在卵巢癌细胞迁移、侵袭中的作用，将在以后的研究进一步完善验证。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨波：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；李胜泽：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；郭苏阳、马珊珊：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；张庆松：进行统计学分析；李玉芝：课题设计，论文撰写