坎格列净纳米晶体冻干粉的制备及其药动学和药效学评价

刘 佳，吉 莉，陈 洁，黄雅菲(南京市溧水区人民医院药剂科，南京 211200)

坎格列净(CFZ)属于钠-葡萄糖共转运蛋白-Ⅱ(SGLT Ⅱ)抑制剂[1-2]，用于治疗2型糖尿病，其作用机制是通过抑制肾脏的近曲小管SGLT-Ⅱ的活性从而抑制葡萄糖重吸收，达到降血糖的目的[3-4]。CFZ属于生物药剂学分类系统(BCS)Ⅳ类药物，水溶性和渗透性均较差，具有肝脏首过效应，且是P糖蛋白(P-gp)的底物，这些因素导致了CFZ口服生物利用度较低[5-6]。纳米晶体(NCs)是由药物和稳定剂构成的纳米或亚微米级胶体水分散体，在增加难溶药物的溶解度和口服生物利用度方面受到广泛关注[7-8]。本研究以维生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(TPGS)和十二烷基硫酸钠(SDS)作为稳定剂，采用高压均质法将CFZ制备成纳米晶体(CFZ-NCs)[9-10]，冷冻干燥成固体粉末，并通过大鼠体内药动学评估药物生物利用度和控制血糖的效果，为CFZ的口服新剂型研究提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器 DRS2000型高速高剪切乳化分散机(德国IKA公司)；APV-2000型超高压均质机(德国APV公司)；Malvern Zetasizer Nano ZSE 纳米粒度电位仪(英国马尔文公司)；Regulus8100冷场发射扫描电镜(日本日立公司)；RC-8MD智能溶出试验仪(天津市精拓仪器科技有限公司)；LGJ-20F冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司)。

1.2试药 坎格列净原料药(CFZ,连云港润众制药有限公司，批号110601，质量分数≥99.8 %)；聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS，北京中生瑞泰科技有限公司)；十二烷基硫酸钠(SDS，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；甘露醇(法国罗盖特公司)；水为纯化水。

1.3实验动物 Wistar大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量为(220±20) g，由江苏卫生健康职业学院提供，动物许可证号：SYXK(苏)2020-0001。

2 方法与结果

2.1CFZ-NCs及其冻干粉的制备 以TPGS和SDS联合使用作为稳定剂[11-12]，采用高压均质法制备CFZ-NCs，并通过冷冻干燥工艺将其固化成固体粉末[13]。制备工艺：使用高速粉碎机将CFZ原料药初步粉碎，原料药粒径分布D90(累积分布为90%的粒径)约为20 μm；取上述CFZ原料药5 g加入到介质溶液100 mL中(含有TPGS的质量浓度为5 mg·mL-1，SDS质量浓度为1 mg·mL-1)，搅拌分散均匀，通过高速剪切分散乳化机(剪切速度为10 000 r·min-1)剪切分散10 min，得到CFZ初级混悬液；再将该混悬液通过高压均质机均质处理(均质压力为800 bar，均质5次)，即得到CFZ-NCs，备用；向CFZ-NCs中加入甘露醇(质量浓度为5 mg·mL-1)，分装到西林瓶中进行冷冻干燥，冻干后加塞密封保存，即得到CFZ-NCs冻干粉。

2.2CFZ-NCs及其冻干粉的质量评价

2.2.1粒径、Zeta电位测定 取新制备的CFZ-NCs以及本批样品的冻干粉末，分别加入纯化水复溶、稀释，使其分散均匀，分别取上述样品置于聚苯乙烯样品池中，通过Malvern Zetasizer Nano ZSE 纳米粒度电位仪测定粒径分布和Zeta电位(光源：HE-NE激光器，波长:632.8 nm，90°散射角，温度：25 ℃)，结果见表1。

由表1可知，CFZ-NCs在冻干前的粒径为(281.7±15.5) nm，多聚分散指数(PDI)为(0.258±0.009)，粒度分布较窄，可减轻药物纳米晶体的奥斯瓦尔德熟化现象[14]，有利于CFZ-NCs的稳定性；CFZ-NCs在冻干前的Zeta电位为(-36.1±1.0)mV，其绝对值大于30 mV，静电排斥力足够大，可有效防止纳米晶体之间相互聚集[15]；CFZ-NCs在冻干后，其粒径分布和Zeta电位均未发生明显变化，说明CFZ-NCs经冷冻干燥后未发生聚集。

表1 CFZ-NCs冻干前后的理化性质Tab.1 The physical and chemical properties of CFZ-NCs before and after lyophilization

2.2.2微观结构 由图1可知，CFZ-NCs加入纯化水稀释，取1滴样品均匀铺展到锡箔纸表面，在红外灯下进行干燥，采用导电胶带将样品黏附在样品台上，离子溅射喷镀金，样品置于扫描电镜下观察微观结构(电压为10 kV，放大倍数为20 000倍)，并拍摄照片。见图1。

图1 CFZ-NCs扫描电镜图Fig.1 Scanning electron micrograph of CFZ-NCs

由图1可知，CFZ-NCs呈不规则颗粒状，表面致密，粒径大部分在100～400 nm之间分布。

2.2.3体外溶出行为研究 评价CFZ混悬剂(以2 g·L-1羧甲基纤维素钠溶液作为分散介质)和CFZ-NCs冻干粉的体外药物溶出行为，选择桨法，转速为50 r·min-1，介质为pH值为1.2的盐酸溶液(含SDS 质量浓度为5 mg·mL-1)，体积为900 mL，温度为(37±0.5) ℃。分别取CFZ混悬剂和CFZ-NCs冻干粉(药物含量均为50 mg)加入到溶出杯中，分别在10、20、30、45、60、90、120 min取出溶出介质5 mL(补加同温同体积空白介质)，用0.22 μm滤膜过滤，稀释后检测药物含量，计算药物溶出度，绘制溶出度-时间曲线。结果见图2。

图2 CFZ混悬剂和CFZ-NCs冻干粉体外溶出度-时间曲线Fig.2 The in vitro dissolution-time curves of CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder (n=6,

由图2可知，CFZ混悬剂中药物溶出速率缓慢，在120 min药物溶出度仅达到20%左右，而将CFZ制备成纳米晶体后，药物溶出速度显著提高，在45 min内药物溶出度基本可达到95%，说明CFZ制备成纳米晶体可显著提高药物的溶出度。

2.3稳定性考察 将CFZ-NCs冻干粉密封在西林瓶中，置于加速稳定性实验箱(40 ℃,相对湿度为75%)中考察稳定性，分别在1、2、3、6个月取样测定CFZ-NCs的理化性质以及在45 min的药物溶出度，结果见表2。结果显示，CFZ-NCs冻干粉在40 ℃条件下放置6个月，其粒径分布、PDI和Zeta电位值基本未发生变化，45 min的药物溶出度也均达到90%以上，说明CFZ-NCs制备成冻干粉后理化性质稳定，可长期保存。

表2 稳定性实验结果Tab.2 The results of stability

2.4体内药动学研究

2.4.1色谱条件 色谱柱：Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相：乙腈-0.02 mmol·L-1正磷酸溶液(55∶45);检测波长：210 nm;柱温：30 ℃;流速:1.0 mL·min-1;进样量：20 μL。

2.4.2血浆处理 采用毛细管通过大鼠眼眶后神经丛取血0.5 mL，置于圆底离心管(内壁涂有肝素)中，以4 000 r·min-1离心10 min，取上层血浆100 μL，置于尖底离心管中，再加入乙腈300 μL，涡旋混合5 min，沉淀蛋白，以4 000 r·min-1离心10 min，取上清液300 μL，置于尖底离心管中，氮气流下挥干有机溶剂，加入流动相100 μL溶解残留物，以10 000 r·min-1离心10 min，取上清液，按照2.4.1项下色谱条件检测药物含量，计算药物质量浓度。

2.4.3动物实验 取Wistar大鼠12只，体质量为(220±20) g，雌雄各半，实验前禁食12 h，自由饮水。将大鼠按照随机数字表法分为A、B 2组，A组大鼠口服给予CFZ混悬剂(以2 mg·mL-1羧甲基纤维素钠溶液作为分散介质)，B组大鼠灌胃给予CFZ-NCs冻干粉，给药剂量均为20 mg·kg-1，在预定的时间点(0、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)采用毛细管通过大鼠眼眶后神经丛取血0.5 mL，置于圆底离心管(内壁涂有肝素)中，离心，分离血浆，按照2.4.2项下方法处理血浆样品并进样分析，数据输入DAS软件中计算药物代谢动力学参数，结果见表3，并绘制血药质量浓度-时间曲线，见图3。

表3 大鼠药物代谢动力学参数Tab.3 The pharmacokinetic parameters of rats

图3 平均血药质量浓度-时间曲线Fig.3 The mean plasma concentration-time curves of CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder

药物代谢动力学结果显示，大鼠口服CFZ-NCs冻干粉后与口服CFZ混悬剂相比，其Cmax和AUC(0-∞)均显著增加，相对生物利用度提高了312.4%。说明CFZ-NCs冻干粉能有效提高CFZ的口服生物利用度。

2.5药效学评价 取Wistar大鼠，体质量为(220±20) g，雌雄各半，禁食不禁水24 h，大鼠腹膜内注射四氧嘧啶溶液(给药剂量为150 mg·kg-1)，诱发糖尿病，定时定量给予稻米，1周后，选择空腹血糖大于16.7 mmol·L-1的大鼠纳入糖尿病模型[16]。将糖尿病模型大鼠随机分成3组，每组6只，第1组大鼠作为空白对照组，给予饮用水，第2组大鼠给予CFZ混悬剂(以2 mg·mL-1羧甲基纤维素钠溶液作为分散介质)，第3组大鼠给予CFZ-NCs冻干粉，给药剂量均为20 mg·kg-1，并通过眼眶后神经丛定时取血0.1 mL，葡萄糖检测试剂盒测定血糖，比较CFZ混悬剂和CFZ-NCs冻干粉的降血糖效果。结果见图4。

图4 CFZ混悬剂和CFZ-NCs冻干粉的大鼠体内血糖水平比较Fig.4 Comparison of blood glucose levels between CFZ suspensions and CFZ-NCs lyophilized powder in rats

由图4可知，糖尿病模型大鼠分别口服CFZ混悬液和CFZ-NCs冻干粉后，其血糖水平均出现降低趋势，口服CFZ-NCs冻干粉的大鼠在各时间点的血糖水平明显低于口服CFZ混悬剂的大鼠，进一步说明CFZ-NCs冻干粉促进了药物溶解和吸收，可持续并显著降低血糖水平。

3 讨论

由于纳米晶体的粒径非常小，比表面积巨大，将药物制备成纳米晶体后相应的表面自由能显著增大，纳米晶体在放置期间易聚集或粒径增大，在处方中加入合适的稳定剂可降低表面张力，避免药物晶体在制备过程和放置过程中聚集[17]。可以采用羟丙甲纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)等高分子聚合物和/或聚山梨酯(Tween 80)、TPGS、SDS等非离子型和离子型表面活性剂作为稳定剂[18-19]。聚合物和非离子表面活性剂吸附在纳米晶体表面，其亲水链向外延伸，阻碍药物晶体之间聚集，通过空间位阻作用达到稳定目的，而离子型表面活性剂吸附在药物晶体表面形成双电层，药物晶体相互靠近，距离减小到某个阈值时，具有相同电荷药物晶体由于静电作用相互排斥，阻碍药物晶体之间聚集。

TPGS作为一种安全无毒、生物相容性好的药物辅料，能抑制细胞膜内的P-gp活性，降低其对底物的外排作用，提高药物渗透率，进而提高药物的口服生物利用度[20-21]，作为一种安全的药用辅料已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于药品中。本研究将CFZ制备成纳米晶体后显著提高了药物口服生物利用度，一方面是由于药物的溶出速度增加，另一方面是由于处方中加入了TPGS，抑制了P-gp活性，降低了P-gp对CFZ的外排作用。