不同基原肉苁蓉的苯乙醇苷、环烯醚萜类特征图谱研究

黄雄梅，黄 艳，农新维，韦敏灵，韦红言[培力(南宁)药业有限公司，南宁 530007]

肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)和管花肉苁蓉[Cistanchetubulosa(Schenk) Wight]是《中国药典》2020年版中规定的2种基原，是我国新疆等沙漠地区的传统名贵补益类中药，药用部位为干燥带鳞叶的肉质茎[1-2]。其主要功效为补肾阳、益精血、润肠通便，用于肾阳不足、精血亏虚等症状的治疗[3-6]。肉苁蓉属为根寄生植物，其寄主为固沙植物梭梭、柽柳属植物等。该属约有22种植物，屠鹏飞等的考证结果表明，中国境内共有4种1变种[7-10]，分别为肉苁蓉、管花肉苁蓉、盐生肉苁蓉及沙苁蓉。由于肉苁蓉的种类众多，从性状上不易将它们区别开，故需建立一种基于特征性化学成分的方法对其进行有效区分。本研究通过建立管花肉苁蓉苯乙醇苷、环烯醚萜类成分的特征图谱[11-14]，对4种常见的基原进行系统地特征图谱对比研究[15-16]，为区别肉苁蓉药材基原提供重要的参考依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 安捷伦LC1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；DAD检测器、色谱柱Agilent ZORBAX Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和万用电炉，均购自天津泰斯特仪器有限公司；XPE205DR型、XSE204型电子分析天平，均购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2试药 松果菊苷(质量分数89.7%，批号111670-201706)、毛蕊花糖苷(质量分数92.5%，批号111530-201713)、肉苁蓉对照药材(批号121276-201102)，均购自中国食品药品检定研究院；管花苷A(质量分数98.6%，批号MUST-17080101)、异毛蕊花糖苷(质量分数99.8%，批号MUST-18051806)，均购自成都曼思特生物科技有限公司；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；超纯水(自制)；其他试剂均为分析纯；肉苁蓉样品来源见表1，经广西药检所韦家福教授分别鉴定为肉苁蓉(CistanchedeserticolaY.C.Ma)、管花肉苁蓉[Cistanchetubulosa(Schrenk) Wight]、盐生肉苁蓉[Cistanchesalsa(C.A.Mey.) G.Beck]、沙苁蓉(CistanchesinensisG.Beck)的干燥带鳞叶的肉质茎。

表1 肉苁蓉样品来源Tab.1 Sources of Herba Cistanche samples

2 方法与结果

2.1色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂[型号：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)]。流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；检测波长：240 nm。流动相：乙腈(A)-1 mL · L-1磷酸溶液(B)。梯度洗脱条件：0～19 min，4% A；19～40 min，4%～6% A；40～45 min，6%～13% A；45～90 min，13%～18% A。

2.2溶液的制备

2.2.1参照物溶液的制备 精密称定肉苁蓉对照药材和管花肉苁蓉对照药材各1 g，加入水50 mL，称定质量，加热回流提取30 min，放冷，用水补足减失的质量，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、异毛蕊花糖苷及肉苁蓉苷A对照品适量，加入体积分数为50%的甲醇制成每1 mL含0.2 mg松果菊苷、0.2 mg毛蕊花糖苷、0.1 mg管花苷A、0.1 mg异毛蕊花糖苷及0.1 mg肉苁蓉苷A的混合溶液，作为对照品参照物溶液。

2.2.2供试品溶液的制备 取收集到的11批药材粉末(过4号筛)各约1 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入水50 mL，称定质量，加热回流提取30 min，放冷，加水补足减失的质量，取续滤液，即得。

2.3峰标定、参照峰和共有峰的选择 按照 2.2项下的方法制备相应的溶液。分别取空白溶剂、参照物溶液及供试品溶液，按照 2.1项下的色谱条件进行测定，进行特征色谱峰的分析定位。见图1。由图1可知，空白溶剂无干扰，管花肉苁蓉有9个共有峰[17-18]，由于松果菊苷的保留时间和响应值较为合适，故将其作为参照峰；结合随行对照的方式，标定了5个峰，即峰6为松果菊苷、峰7为毛蕊花糖苷、峰8为管花苷A、峰9为异毛蕊花糖苷、峰10为肉苁蓉苷A[19-22]。其中峰10属于肉苁蓉和盐生肉苁蓉基原的特征峰。

图1 管花肉苁蓉特征图谱注：A.空白溶剂；B.对照品参照物溶液；C.供试品溶液；6.松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8.管花苷A；9.异毛蕊花糖苷；10.肉苁蓉苷A。Fig.1 Characteristic chromatograms of Cistanche tubulosa (Schenk) Wight

2.4精密度考察 精密吸取同一份供试品溶液，按规定的色谱条件测定特征图谱，连续进样6次。结果表明，9个共有峰的相对保留时间和相对峰面积无明显差别，RSD值均小于3.00%，说明仪器精密度良好。

2.5重复性考察 精密称取同一批号的管花肉苁蓉6份，按上述方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件测定特征图谱。结果表明，9个共有峰的相对保留时间和相对峰面积无明显差别，RSD值均小于3.00%，说明本方法的重复性良好。

2.6稳定性考察 按2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置0、5、10、15、20、24 h进样，按2.1项下的色谱条件测定特征图谱。结果表明，9个共有峰的相对保留时间和相对峰面积无明显差别，RSD值均小于3.00%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7样品特征图谱测定 分别取4种常见基原共11批药材，见表1，按2.2项下的方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件测定特征图谱，结果见图2。4种基原特征图谱叠加见图3。

图2 4种肉苁蓉基原特征图谱注：A．4批管花肉苁蓉特征图谱；B．4批肉苁蓉特征图谱；C．2批盐生肉苁蓉特征图谱；D．3批沙苁蓉特征图谱；G1～G4.管花肉苁蓉药材；R1～R4.肉苁蓉药材；Y1～Y2.盐生肉苁蓉药材；S1～S3.沙苁蓉药材；1～5.未知峰；6.松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8.管花苷A；9.异毛蕊花糖苷；10.肉苁蓉苷A;11～12.未知峰。Fig.2 Characteristic chromatograms of Herba Cistanche of 4 originsNotes:A.4 batches of C.tubulosa (Schenk) Wight；B.4 batches of C.deserticola Y.C.Ma;C.2 batches of C.salsa (C.A.Mey.) G.Beck；D.3 batches of C.sinensis G.Beck；G1-G4.Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight；R1-R4.Cistanche deserticola Y.C.Ma；Y1-Y2.Cistanche salsa (C.A.Mey.) G.Beck；S1-S3.Cistanche sinensis G.Beck；1-5.unknown peaks; 6.echinacoside;7.verbascoside;8.tubuloside A;9.isoacteoside;10.cistanoside A；11-12.unknown peak.

图3 4种肉苁蓉基原特征图谱叠加注：R.对照品参照物溶液；R1.肉苁蓉；G1.管花肉苁蓉；Y1.盐生肉苁蓉；S1.沙苁蓉；6．松果菊苷；7.毛蕊花糖苷；8：管花苷A；9.异毛蕊花糖苷；10：肉苁蓉苷A;11～12.未知峰。Fig.3 Superimposed characteristic chromatograms of Herba Cistanche of 4 originsNotes:R.standard reference solution；R1.Cistanche deserticola Y.C.Ma；G1.Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight；Y1.Cistanche salsa (C.A.Mey.) G.Beck；S1.Cistanche sinensis G.Beck；6.echinacoside;7.verbascoside;8.tubuloside A;9.isoacteoside;10.cistanoside A;11-12.unknown peak.

2.8不同基原肉苁蓉的特征图谱 由图2中的4批管花肉苁蓉及其对照药材的特征图谱可知，管花肉苁蓉药材有9个特征峰，与其对照药材的特征峰能一一对应。由于管花肉苁蓉药材基原通过药材性状就能辨认，故将管花肉苁蓉的特征图谱作为参照基础，区别其他3种基原。肉苁蓉的特征图谱与管花肉苁蓉比较，多出峰10，3批肉苁蓉及对照药材共有10个特征峰，见图2B。盐生肉苁蓉的特征图谱与管花肉苁蓉比较，缺少峰7、8、9，而多出峰10，2批盐生肉苁蓉共有7个特征峰，见图2C。沙苁蓉的特征图谱与管花肉苁蓉比较，多出2个未知峰，即峰11和峰12，而缺少峰1～6和峰8，共有4个特征峰，见图2D。峰11和峰12可作为判别沙苁蓉基原特有的色谱峰。

综上所述，在2.1项下的色谱条件下，管花肉苁蓉基原应有9个共有特征峰；肉苁蓉基原应有10个共有特征峰，与管花肉苁蓉基原相比，多出峰10，即肉苁蓉苷A；盐生肉苁蓉基原应有7个共有特征峰，与管花肉苁蓉基原相比，缺少峰7～9，而多出峰10，即肉苁蓉苷A；沙苁蓉基原应有4个共有特征峰，峰11和峰12可作为沙苁蓉基原特有的色谱峰。

3 讨论

3.1样品提取溶剂考察 本研究对提取溶剂进行考察，比较了体积分数为50%的甲醇、甲醇、体积分数为50%的乙醇及水。结果表明，不同溶剂对色谱峰的数量及峰面积的影响不大，从溶剂毒性与安全性的角度考虑，选择水作为提取溶剂。分别考察超声和回流2种不同的提取方式，结果表明，应用回流提取方式时，各色谱峰的响应值较大，故提取方法选择回流。对不同的提取时间进行考察，分别回流30、45、60 min，结果表明，提取不同时间的色谱峰峰面积和色谱峰的数量基本一致，为简化操作，故选择提取时间为30 min。对提取次数进行考察，结果提取1次与提取多次的色谱峰数量无明显差异，故选择提取次数为1次。最终确定用水回流提取30 min、提取1次的方法。

3.2检测波长的选择 朱乃亮等[11]的研究表明，肉苁蓉的主要成分为苯乙醇苷和环烯醚萜苷。本研究使用Agilent的紫外检测器进行紫外区全波长扫描，苯乙醇苷的最大吸收值出现在330 nm处[23-26]，环烯醚萜苷类的最大吸收值在约240 nm处[27-29]，两类成分在240 nm处均有较大吸收值，呈现的色谱峰数量较多，且响应值较高，各色谱峰的分离度和峰形良好。综合考虑，选择240 nm作为本研究的检测波长。

3.3肉苁蓉特征图谱分析与评价 肉苁蓉的不同基原仅依据性状不能很好地辨别，故本研究结合药材性状建立特征图谱的方法，对不同基原的肉苁蓉进行了研究。以管花肉苁蓉和对照药材特征图谱为参照，其他3种基原的特征图谱与之相比有明显的差异，本方法能有效区分不同基原的肉苁蓉，为对肉苁蓉进行进一步的质量评价提供依据，也为后续区分不同基原肉苁蓉的相关研究提供了参考。