基于L-Arg／NOS／NO通路探讨八段锦干预原发性高血压的机制研究

郑丽维 ，陈祖森 ，陈 丰 ，刘 静 ，葛 莉

（1.福建中医药大学护理学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004）

血管内皮功能障碍在原发性高血压（essential hypertension，EH）的发生发展过程中起到关键作用［1-3］，其与舒血管因子一氧化氮（NO）生成减少密切相关，NO 是由左旋精氨酸（L-Arginine，L-Arg）在一氧化氮合酶蛋白（nitric oxide synthase，NOS）催化作用下生成，NO的合成取决于细胞内其底物LArg的含量与细胞膜对L-Arg的跨膜转运，以及催化物NOS的活性与表达水平，并在此反应基础上构成 L-Arg／NOS／NO 通路［4-5］。 目前该通路已经成为许多干预措施的干预靶点，通过调控此通路可有效控制EH患者的血压水平［6-7］。本课题前期研究结果显示［8］，经过规律的八段锦运动干预，八段锦组患者NO浓度较对照组明显升高（P＜0.05），提示规律性八段锦运动可促进患者NO合成与释放，改善其血管内皮舒缩功能。而如前述，NO是L-Arg／NOS／NO通路的关键因子，与内皮细胞功能密切相关。因此，本研究拟通过对EH患者进行24周的八段锦运动干预，从L-Arg／NOS／NO通路探索八段锦调控EH患者血压的作用靶点，为八段锦在临床的应用提供基础研究证据。

1 临床资料

1.1 诊断标准 高血压诊断及分级标准参照《中国高血压防治指南（2018 年修订版）》［9］。

1.2 纳入标准 ① 符合1级、2级高血压诊断标准的门诊患者；② 年龄45～75岁；③ 降压治疗用药为乐卡地平和（或）氯沙坦钾者；④ 经过宣传和动员，自愿参加本研究并签署知情同意书者。

1.3 排除标准 ①继发性高血压、急进性高血压患者；② 合并有心、肝、肾、脑功能衰竭、糖尿病等严重合并症者；③ 合并有认知障碍及肢体障碍者；④ 精神障碍患者；⑤ 有规律性运动（连续10周，每周运动3次以上，每次30 min）者。

1.4 一般资料 研究对象的招募地点选择在福建中医药大学附属人民医院，招募时间为2017年9月1日—2018年1月31日。本研究共招募受试志愿者267例，按照纳入、排除标准严格筛查后，排除不符合纳入标准的136例，符合排除标准的25例，阅读知情同意书后不愿参加研究的共44例，最终筛选出62例患者进入本研究，随机分为对照组和八段锦组。2组基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，见表1。本研究经过福建中医药大学附属人民医院伦理委员会审查后批准开展此项研究，伦理审查批件号：2017-043-03。

2 研究方法

2.1 样本量计算及分组 ① 样本量计算：按照计量资料两样本均值比较样本含量估算公式：n1＝n2＝2（μα+μβ）2S2／δ2， 其 中S2＝（Se2＋Sc2） ／2，δ＝。Xe、Xc与Se、Sc分别为八段锦组和对照组的均数与标准差，检验水平α取0.05（双侧），二类错误概率β取0.1。参考前人研究结果［10］，以上数据按公式算得各组样本量为25.69，失访率按20%计算，得八段锦组和对照组各需31例。② 分组：由不参与研究招募、结局测量及统计分析的硕士研究生采用Microsoft Office Excel软件产生随机序列，并制作随机分组卡。

2.2 分配隐藏及盲法的设置 将随机分组卡装入密封、不透光的纸质信封中，将信封按顺序编码。干预前患者按其纳入本研究的顺序编号，选择与之相对应的信封，依据信封中随机分组卡上的组别进行分组后，研究者对患者进行基线资料的评估与采集。本研究仅对血液指标测量者及血压测量者设盲。

表1 2 组一般资料比较（n，%）／（±s）

表1 2 组一般资料比较（n，%）／（±s）

对照组（n＝3 1）八段锦组（n＝3 1）χ 2／t／Z 值P值项 目性别男女1 3（4 1.9）1 8（5 8.1）1 5（4 8.4）1 6（5 1.6）0.2 6 1 0.6 1 0 1 2（3 8.7）1 9（6 1.3）1 6 4.3 5±8.2 7 5 9.0 3±5.9 2年龄／岁4 5～6 0 6 1～7 5身高／c m体质量／k g婚姻状况在婚丧偶分居／离异职业（下岗／退休前职业）工人行政干部专业技术人员农民其他文化程度初中及以下高中／中专大专及以上1 3（4 1.9）1 8（5 8.1）1 6 5.4 5±7.0 1 5 9.3 5±5.4 0 0.0 6 7-0.7 0 6 0.2 2 4 0.7 9 6 0.4 8 0 0.8 2 3 2 7（8 7.1）1（3.2）3（9.7）2 4（7 7.4）4（1 2.9）3（9.7）1.9 7 6 0.3 7 2 1 8（5 8.1）3（9.7）5（1 6.1）2（6.4）3（9.7）1 6（5 1.6）6（1 9.4）4（1 2.9）3（9.7）2（6.4）1.6 2 9 0.8 0 4 2 0（6 4.5）8（2 5.8）3（9.7）1 4（4 5.2）1 4（4 5.2）3（9.6）-1.3 3 1 0.1 8 3

2.3 干预方法

2.3.1 对照组 对照组不作任何规律运动的干预，采用常规治疗与健康教育，参照《中国高血压防治指南（2018修订版）》给予常规处理。治疗用药为：乐卡地平片（重庆圣华曦药物股份有限公司，批号：170802），每次 10 mg，每日 1 次；和（或）氯沙坦钾片（重庆科瑞制药有限公司，批号：247003），每次50～100 mg，每日1次，均于晨起后早饭前15 min服用。健康教育包括：用药指导、饮食指导、心理指导等。

2.3.2 八段锦组 在常规治疗与健康教育基础上进行八段锦运动干预（参照国家体育总局2003年颁布的新编健身功法标准执行［11］）。每周运动5 d，每日1次，每次练习2遍，每遍13 min，两遍之间休息5 min，共干预24周。提前由研究者进行八段锦培训，告知八段锦运动过程中的注意事项以及各式动作的详细步骤，给予现场指导，免费发放课题组自制的八段锦运动教程光盘及八段锦运动指导手册。干预期间患者前4周每周于医院内（中医药文化宣传教育基地）集中练习2次，八段锦背景音乐及视频在基地内统一播放，研究者现场指导患者进行练习，以后每2周1次现场指导及练习。其余时间由患者自行在家中进行锻炼。研究者每周通过门诊或入社区随访1次，记录患者用药与疾病情况，了解八段锦组患者的运动情况；每2天通过电话／短信／微信的方式提醒八段锦组患者进行八段锦运动及了解其锻炼的感受，确保患者锻炼的依从性及准确性。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 指标检测 所有受试者于干预前（进入研究后次日上午 8∶00—9∶00）、干预后（第 25 周第 1 天上午 8∶00—9∶00）空腹采集静脉血 5 mL，血小板的制备参照文献［12］。① 精氨酸酶Ⅱ（Arginase-Ⅱ，Arg-Ⅱ）蛋白表达：采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司（F00107）；②NOS蛋白活性：采用分光光度法测定，试剂盒购自南京建成生物有限公司（A014-2）；③ NOS蛋白表达：采用酶联免疫吸附法测定，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司（F00670）；④ NO水平：采用硝酸还原酶法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所（A012）。以上指标均由福建中医药大学附属人民医院检验科进行检测。

2.4.2 血压值检测 分别于干预前和干预后每4周检测 2 组收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP）（上午 8∶30）。参照《中国血压测量指南（2011 版）》［13］血压测量标准由在心血管内科规培的一名医生进行测量。采用经过校验的电子血压计（欧姆龙HEM-8102A），测量精度：压力±4 mm Hg（0.5 KPa），选择坐位、右上臂肱动脉进行测量。

2.4.3 安全指标 对本研究过程中出现的不良事件予以记录，并分析是否为本次研究干预所引起。

2.5 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行数据统计分析，所有检验均采用双侧检验，以P＜0.05认为差异有统计学意义，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料以例数 n（%）表示。组间比较，数据符合正态性检验采用两独立样本t检验，不符合则采用秩和检验。组内比较，数据干预前后的差值若符合正态性检验采用配对样本t检验，不符合采用配对样本秩和检验；血压值采用重复测量方差分析，对满足球形性对称假设，采用一元方差分析结果，不服从则采用Greenhouse-Geisser方法进行校正分析。

3 结 果

3.1 病例完成情况 研究过程中，八段锦组失访5例（去省外照顾孙子1例、无法坚持干预自动退出1例、去外地出差中断干预1例、失去联系2例），对照组失访4例（自行调整用药2例、失去联系1例、不愿进行干预后指标评定1例）。

3.2 2组干预前后Arg-Ⅱ蛋白表达、NOS蛋白表达、NOS蛋白活性及NO表达比较 见表2。

表2 2组干预前后Arg-Ⅱ、NOS蛋白活性和蛋白表达、NO表达比较（±s）

表2 2组干预前后Arg-Ⅱ、NOS蛋白活性和蛋白表达、NO表达比较（±s）

注：与干预前比较，1） P＜0.05；与对照组比较，2） P＜0.05。

N O／（μ m o l／L）1 7 5.5 7±1 2 8.4 2 1 6 3.2 5±1 1 2.0 8-1 2.3 2±4 2.4 4 2 2 0.9 5±1 3 3.4 4 2 2 8.4 9±1 3 3.4 4 1）2）7.5 4±7.3 3 2）组别n对照组2 7八段锦组2 6干预前干预后差 值干预前干预后差 值A r g-Ⅱ蛋白表达 ／（n g／m L）1.8 0±0.9 1 1.9 0±0.8 6 0.1 0±0.5 3 1.9 1±0.9 4 1.7 8±0.9 9-0.1 4±0.4 6 N O S 蛋白表达 ／（p g／m L）0.7 5±0.2 6 0.7 4±0.3 1-0.0 1±0.1 5 0.7 2±0.2 9 0.8 9±0.3 1 1）2）0.1 7±0.1 8 2）N O S 蛋白活性／（U／m L）1 9.9 6±3.7 3 1 9.7 8±3.9 0-0.1 8±0.7 8 1 9.0 8±3.2 3 2 1.1 4±3.7 3 1）2.0 6±1.6 4 2）

3.3 2组干预前后血压值比较 见表3。

表3 2组干预前后血压值比较（±s）mm Hg

表3 2组干预前后血压值比较（±s）mm Hg

注：与干预前比较，1） P＜0.05；与对照组比较，2） P＜0.05。

干预1 2周1 3 3.7 0±4.0 3 7 9.6 3±2.8 3 1 3 1.2 3±2.2 7 1）2）7 7.4 6±3.6 9 2）组别对照组n 2 7八段锦组2 6血压S B P D B P S B P D B P干预前1 3 4.4 4±4.0 5 8 0.8 9±4.3 4 1 3 4.9 2±3.7 6 8 0.5 4±4.0 6干预4周1 3 4.1 5±2.5 4 8 0.0 7±4.1 3 1 3 3.5 4±3.0 6 7 9.5 4±3.8 1干预8周1 3 3.8 5±3.4 2 8 0.3 0±4.0 3 1 3 3.0 8±3.8 0 1）7 8.4 6±3.7 2干预1 6周1 3 3.7 8±3.6 5 7 9.1 1±2.5 6 1 3 1.8 5±3.6 6 1）7 7.2 3±2.6 0 2）干预2 0周1 3 3.6 3±4.0 0 7 8.3 7±2.0 8 1）1 3 1.3 1±3.5 3 1）2）7 6.5 4±2.6 3 2）干预2 4周1 3 3.3 3±2.3 5 7 7.9 3±2.4 5 1）1 3 0.2 3±3.3 6 1）2）7 6.0 0±2.6 5 2）

3.4 安全性分析 在干预过程中，未发现患者发生与八段锦运动干预措施相关的不良事件，如肌肉痉挛、跌倒损伤等。

4 讨论

KUO等［14］研究提出，人体中 Arg-Ⅱ的 Km值为0.5～29 mm，虽然相较于NOS的Km值（1～20 μm）高得多，但需注意的是，Arg-Ⅱ的Vmax为1 400 μmol／（min·mg），显著高于 NOS 的 Vmax［900 μmol／（min·mg），因此基于这两种酶的动力学与生物化学分析，可知Arg-Ⅱ在正常状态下可与NOS竞争其底物L-Arg，降低NOS的生物利用率，最终影响 NO的合成。若Arg-Ⅱ表达量增加，则与NOS结合的LArg底物量就相对减少，Arg-Ⅱ表达量与L-Arg／NOS／NO通路的调节密切相关。本研究因受实验条件限制，未直接测量L-Arg的转运量，故采用Arg-Ⅱ蛋白的表达间接反应L-Arg的底物水平。此外，多项研究证实，血小板存在L-Arg／NOS／NO转运通路，患者发生EH时，其变化与血管内皮的L-Arg／NOS ／NO 转运通路一致［4，15-16］，因 此本研究选 用 血小板检测相关蛋白，探究八段锦运动对EH患者的作用机制。

4.1 对EH患者Arg-Ⅱ蛋白的影响 由于Arg-Ⅱ在人类及其他物种的内皮细胞中作为调节NO合成的重要物质而存在，因此抑制其表达可有效地防止血管内皮功能受损及延缓相关心血管疾病的进展［17］。本研究经过24周的八段锦运动干预后，患者Arg-Ⅱ蛋白水平呈下降趋势。但由表2可知，干预前后2组Arg-Ⅱ蛋白水平及其差值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。这可能与以下原因有关：① 本研究样本量较小，且干预时间仅为24周，课题组未对患者进行长期的随访跟踪，因此尚未发现患者Arg-Ⅱ蛋白表达水平发生显著改变。② 研究显示，氧化型低密度脂蛋白在体内外均可上调聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（PARP-1）表达，而PARP-1升高所介导的Arg-Ⅱ表达上调可造成血管内皮功能发生不同程度的损伤［17］。本研究纳入对象中有高血脂病史者占多数（71%），其脂代谢的异常可引起Arg-Ⅱ表达异常，且随着年龄的增长与并发症的产生，改善患者Arg-Ⅱ表达异常的难度加大。③ 近年研究提出，Arg-Ⅱ蛋白活性增强可导致NOS／NO系统失调，具体表现为血管壁对NO的生物利用度下降和L-Arg结合率上升，该过程可促进四氢叶酸辅因子发生氧化反应，同时导致NOS的解偶联与活性氧（ROS）的生成，最终引起血管损伤和功能障碍［18］。本研究Arg-Ⅱ蛋白水平虽无统计学改变，但Arg-Ⅱ蛋白活性经干预后可能已产生变化，由于课题组未测量患者干预前后Arg-Ⅱ蛋白活性水平，经查阅文献，也尚未发现有关八段锦运动干预EH患者Arg-Ⅱ蛋白变化的研究，因而无法进行比较分析，还需今后的研究加以验证。

4.2 对EH患者NOS蛋白活性、NOS蛋白表达水平的影响 本研究结果显示，干预24周后八段锦组NOS蛋白水平呈上升趋势（P＜0.05），且明显高于对照组（P＜0.05），说明八段锦运动具有上调EH患者NOS蛋白表达水平的作用，而该指标的改善可能是八段锦运动提高患者血管内皮功能的一个重要原因。本研究结果还显示，干预后八段锦组NOS蛋白活性明显上升（P＜0.05），表明八段锦运动不仅可提高患者NOS蛋白表达，还可提高其活性水平，这对于稳定EH患者血管稳态，维持血压平稳，延缓血管内皮受损具有重要意义。游剑虹等［19］研究证实，渐进式有氧运动可提高SD大鼠的血管内皮依赖性舒张功能（EDD），使NOS表达增加，运动所具有的心血管保护作用，可能是通过增加eNOS表达和提高eNOS磷酸化来实现。还有研究提出，血管内切应力在运动时呈上升趋势，此过程能显著提高NOS活性［20］。长期规律的运动则可通过增强对NOS mRNA的表达，使血管内皮和骨骼肌的NOS合成和释放量增高，最终引起NO合成的增加。

4.3 对EH患者NO水平的影响 国内外学者认为，有氧运动能有效地使氧自由基下降，为内皮细胞形成保护屏障使其免受损害［21-22］。运动锻炼还可提高对抗自由基反应酶的活性，防止NO被灭活，增强NO生物转换率与利用度，提高细胞中谷胱甘肽（GSH）的含量来增强血管的内皮依赖性舒张功能，且可帮助内皮细胞释放NO，进而保护血管内皮，已发生损伤的内皮功能可通过运动发生逆转［23］。林秋等［24］将八段锦运动应用于EH患者的康复中，结果表明八段锦能通过调节机体血管内皮舒缩因子的表达水平，从而维持血管压力的平衡。本研究也得出了类似结论，经过24周八段锦运动干预，患者NO水平得到明显提高（P＜0.05）。本课题前期研究［8］结果也显示，经过八段锦运动干预后，八段锦组患者NO水平呈上升趋势，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示八段锦运动可改善EH患者的血管内皮功能，其机制与提高患者NO水平有关。近期研究也证明，中医传统养生康复运动具有延缓EH患者血管内皮损伤，减少血管平滑肌增殖，提高心血管循环功能的效果，而血管内皮功能每上升1个百分点，心血管疾病（包括高血压）的风险便可降低 13%［25-26］。

4.4 对EH患者血压的影响 本研究结果显示，干预后患者SBP值及DBP值呈下降趋势。对照组患者干预后SBP亦呈下降趋势，说明常规治疗与健康教育和八段锦均有一定降压效果，但八段锦组降压效果更显著，提示八段锦是辅助治疗高血压的有效方法。以往的研究也指出，进行12～24周的八段锦运动可使1、2级的EH患者SBP水平下降6～11 mm Hg，DBP水平下降4～7 mm Hg，无论是对SBP还是DBP均可表现出良好的降压疗效［27］，本研究得出了类似结论。

由表3可知，2组患者的SBP在时间、组别以及时间与组别的交互效应上均具有统计学意义（P＜0.05），说明2组患者的SBP会随着干预时间的延长而呈下降趋势，原因可能与患者在干预期间接受常规治疗与健康教育，血压得到有效控制有关。2组患者的DBP在时间效应、组别效应上均有统计学意义（P＜0.05），说明患者 DBP随干预时间的增加而下降，且八段锦组患者的DBP下降程度优于对照组。不同时间点的两两比较结果显示，干预12周、16周、20周、24周后，2组患者 SBP、DBP差异均有统计学意义（P＜0.05），八段锦组DBP水平低于对照组，与多项研究结果类似［28-29］，表明八段锦运动在控制患者血压方面具有积极作用。中医认为，八段锦动作柔缓，连贯而圆活，且动静相兼，时常练习有调理脏腑、促进经络气血运行及平衡阴阳的功效。现代研究发现，八段锦的运动强度适中，长期规律的锻炼能改善EH患者的心功能，提高心肌收缩力及心脏射血能力，改善患者在静息状态时的心脏代谢，减少心肌细胞耗氧量［30］。还有研究认为，八段锦运动具有降压疗效主要与以下机制有关：习练八段锦可有效增强EH患者血管的弹性功能，减轻内皮损伤，其还具有独特的“调息、调心”作用［31-32］，患者进行锻炼时通过有意地延长呼气动作，可提高呼吸中枢的兴奋性，刺激副交感神经，降低血管阻力。本研究则认为，八段锦运动具有良好的降压效果，其机制与八段锦运动提高患者血管内皮功能密切相关。如前述，经过24周的八段锦运动干预，患者NOS蛋白表达、蛋白活性及NO水平均较干预前显著提高，而NOS与NO的合成与释放增加有利于减轻患者血管的狭窄痉挛状态，在血压控制中起到关键作用。

八段锦为徒手定步功法，简单易学，安全有效，且不受场地限制，在社区及家庭中积极推广普及八段锦，符合我国目前倡导以家庭和社区为单位开展自我康复与管理的发展模式。本研究结果提示，八段锦运动具有降低EH患者SBP、DBP的作用，其机制可能与上调L-Arg／NOS／NO通路中的NOS表达与促进NO生成有关。但血压可受到多种因素影响，未来可延长干预时间，扩大样本量，增加氧化应激标志物、血栓素等指标，从分子及生物学角度系统分析八段锦的降压机制。