不同煎煮时间对茯苓饮片水溶性多糖含量的影响*

卫修来，卢雨晴，程钢

1 安徽医科大学第一附属医院 安徽合肥 230022

2 安徽省六安市人民医院 安徽六安 237000

茯苓为多孔菌科真菌茯苓（Poriacocos （Schw.）Wolf）的干燥菌核，味甘、淡，性平，具有利水渗湿，健脾，宁心之功效，为中医临床常用药物之一。《中国药典》（2015年版，1部）将鲜茯苓按不同部位切制，阴干后，分为“茯苓块”和“茯苓片”[1]。茯苓块为方块状，较为厚；茯苓片为薄片，较茯苓块长。茯苓的主要化学成分是多糖、三萜、脂肪、蛋白质等物质，其中茯苓多糖作为茯苓药材的活性成分之一，具有提高机体免疫力的作用。[2]茯苓多糖包括水溶性多糖和醇溶性多糖[3-4]，临床上通过传统煎煮方法获得的是水溶性多糖，本次实验以水溶性多糖为指标，考察煎煮时间对两种不同规格的茯苓饮片中水溶性多糖溶出的影响，这在一定程度上影响了茯苓的药效。本实验使用苯酚-硫酸法联合3，5-二硝基水杨酸（DNS）法[5-8]测定茯苓中水溶性多糖含量，苯酚-硫酸法测总糖含量，DNS法测单糖含量，二者之差为茯苓多糖含量。利用上述方法对茯苓饮片的2种规格（茯苓块和茯苓片）不同煎煮时间水煎液中茯苓多糖含量进行考察，以此为中药饮片的临床使用提供参考。

仪器与试药

1 仪器

TU-1810型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；2104型电子天平（上海天平仪器厂）；德尔（Deer）DH64型电热恒温干燥箱（上海医疗器械七厂）；H.H.S21-4型电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂）； SZ-1型快速混匀器（金坛市华峰仪器有限公司）。

2 试药

茯苓块（安徽井泉中药有限公司，产地安徽，批号为20180701、20180801、20180901，对应编号为A、B、C）；茯苓片（安徽井泉中药有限公司，产地安徽，批号为20180301、20180401、20180701，对应编号为D、E、F），经安徽医科大学第一附属医院葛朝亮副主任中药师鉴定为茯苓块和茯苓片，符合2015版《中国药典》一部规定。葡萄糖对照品（批号：10042112，上海源叶生物科技有限公司）；苯酚（批号：20150503，上海聚泰特种试剂有限公司，分析纯）；硫酸（批号：180504，无锡市展望化工试剂有限公司，分析纯）；3，5-二硝基水杨酸（批号：14147181，广州和为医药科技有限公司，分析纯）；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水。

方法与结果

1 葡萄糖对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品0.01g，置100mL量瓶中，以水溶解并稀释至刻度，摇匀，得0.1g/L的葡萄糖对照品溶液①；同法制备浓度为1.0 g/L的葡萄糖对照品溶液②。

2 供试品溶液的制备

称取各批次饮片各50 g，置2000 mL不锈钢量杯中，加10倍量蒸馏水，浸泡30 min后置电磁炉上，大火煮沸后分别保持微沸15 min，30 min，45 min，趁热以2层纱布过滤；各组药渣再以8倍量蒸馏水大火煮沸保持微沸15 min，趁热2层纱布过滤；合并两次滤液，放至室温，转移至1000 mL量瓶中，加水稀释至刻度，得浓度为0.05 g/mL的茯苓饮片水煎液。

3 苯酚-硫酸法测定水煎液中总糖含量

3.1 线性关系考察 分别精密吸取0.1g/L的葡萄糖对 照 品 溶 液 各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL置 于6个10 mL刻度试管中，分别加水至1mL，精密加入5%苯酚溶液2mL，立即用快速混匀器混匀，以单标线移液管迅速加入5 mL硫酸，移液管硫酸流尽后靠壁15s，取出移液管，混匀后置于沸水浴中加热15 min，迅速取出，置于冰水中冷却3 min，取出混匀并放至室温。以0 mL溶液为空白，在490 nm波长测定吸光度，以浓度C （μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A = 0.0072C + 0.0161（r=0.9997），结果表明葡萄糖浓度为21～75μg/mL时线性关系良好。

3.2 精密度试验 精密移取茯苓总糖提取液0.5 mL、，加水补足至1.0 mL，按照“3.1”项下方法操作，依次连续测定6次吸光度，结果RSD为0.46%，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验 精密移取茯苓总糖提取液0.5 mL，加水补足至1.0 mL，按照“3.1”项下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min测定吸光度，结果RSD分别为0.34%，表明茯苓总糖提取液中总糖显色后在2 h内稳定。

3.4 重复性试验 分别精密移取同一批次6份茯苓总糖提取液0.5 mL，加水补足至1.0 mL，按照“3.1”项下方法操作，测定吸光度，结果RSD分别为0.57%，表明苯酚-硫酸法的重复性良好。

3.5 加样回收率试验 精密吸取已知含量的茯苓总糖提取液28.755μg，平行6份，分别精密加入0.1g/L的葡萄糖对照品溶液28.000μg，加水补足至1.0 mL，按照“3.1”项下方法操作，于490nm波长下测定吸光度并计算回收率，平均回收率（n=6）为102.70%，RSD为1.23%，符合测定要求。见表1。

3.6 不同煎煮时间的茯苓总糖含量测定 分别精密吸取各批次传统汤剂0.2mL于10mL量瓶中，加水稀释至1mL，分别按照“3.1”项下方法操作，测定各批次传统汤剂的吸光度，根据苯酚-硫酸法标准曲线和样品浓度，计算各批次茯苓传统汤剂中总糖的含量。

4 DNS法测定水煎液中单糖含量

表1 苯酚-硫酸法加样回收率考察

4.1 线性关系考察 分别精密吸取1.0 g/L的葡萄糖对照品溶液0，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL于10 mL量瓶中，加水补足至2.0 mL，摇匀，分别精密加入DNS试液3.0 mL，摇匀，置于沸水浴中加热5 min，取出，迅速流水冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀。[9]以0 mL溶液为空白，在540 nm波长下测定吸光度，以浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A = 0.0182C- 0.1354 （r= 0.9999），结果表明葡萄糖浓度为20～51μg /mL时线性关系良好。

4.2 精密度试验 精密移取茯苓总糖提取液2.0 mL，按照“4.1”项下方法操作，依次连续测定6次吸光度，结果RSD为0.37%，表明仪器精密度良好。

4.3 稳定性试验 精密移取茯苓总糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”项下方法操作，在0、20、40、60、80、100、120 min测定吸光度，结果RSD为0.80%，表明茯苓总糖提取液中单糖显色后在2 h内稳定。

4.4 重复性试验 分别精密移取6份茯苓总糖提取液2.0 mL，按照 “4.1”项下方法操作，测定吸光度，结果RSD分别为0.46%，表明DNS法的重复性良好。

4.5 加样回收率 精密吸取已知含量的茯苓总糖提取液178.479μg，平行6份，分别精密加入1.0g/L的葡萄糖对照品溶液160.000μg，加水补足至2.0 mL，按照 “4.1”项下方法操作，于540nm波长下测定吸光度并计算回收率，平均回收率（n=6）为101.06%，RSD为和1.15%，符合测定要求。见表2。

表2 DNS法加样回收率考察

4.6 不同煎煮时间的茯苓单糖含量测定 分别精密吸取各批次传统汤剂0.5mL于10mL量瓶中，加水稀释至2mL，分别按照“4.1”项下方法操作，测定各批次传统汤剂的吸光度，根据DNS法标准曲线和样品浓度，计算各批次茯苓传统汤剂中单糖的含量。

5 不同煎煮时间下茯苓多糖含量测定结果

茯苓片与茯苓块测定结果见表3，表4。结果表明，茯苓饮片传统汤剂中茯苓多糖含量随煎煮时间的增加而增加，且煎煮45 min时茯苓片煎煮液中茯苓多糖含量与茯苓块煎煮液相比无明显差异，见图1。

表3 不同煎煮时间下茯苓块水煎液中茯苓多糖的含量

表4 不同煎煮时间下茯苓片水煎液中茯苓多糖的含量

讨 论

图1 不同煎煮时间下茯苓块与茯苓片水煎液中多糖含量（■茯苓块 ●茯苓片）

本实验通过对茯苓饮片的15，30，45min3个不同煎煮时间进行考察，发现煎煮45min的茯苓传统汤剂中茯苓多糖含量明显较高，且煎煮15min的水煎液中茯苓多糖含量最小。根据图1可知，茯苓水煎液在煎煮30～45min过程中，茯苓多糖增长率明显低于煎煮15～30min。

在实验研究初期，我们曾参照文献尝试采用了80%乙醇除杂过滤，再水提多糖以硫酸-苯酚法或硫酸-蒽酮法测定多糖[10]，但因为茯苓中水溶性多糖含量很低（＜0.3%），往往需要较大的取样量（≥2g），这样在除杂过滤时较慢，吸附在残渣上的单糖不易洗净除去，从而使结果的重复性较差，不易获得准确的结果。而另一种方法水提醇沉也需要多糖含量较高才能够沉淀出来，少量的沉淀较为松散而易随乙醇流失，在茯苓多糖的提取中显然不具备优势。本实验采用的多糖含量测定方法为：水提总糖，测其总糖及单糖含量，两者之差为多糖含量。本方法只需一次提取，避免因多次提取及转移过滤造成的多糖损失，同时解决了因多糖含量较少而无法采用水提-醇沉法提取的问题，既保证了提取的充分，又大大减少了操作步骤及时间，且使整体实验操作误差减小。

DNS法作为茯苓单糖含量的测定方法，使用前需按紫外-可见分光光度法方法测定，在200～600nm范围内进行扫描，结果表明样品溶液最大吸收波长为505nm。在含量测定的实验过程中，505nm波长下样品溶液及空白对照所测吸光度均不稳定，推测该波长下溶液发生某种可逆的物理或化学变化。通过查阅相关文献及报道，最终确定测量波长为540nm，[11]此时样品溶液吸光度稳定且重复性和精密度均较好。

综上所述，茯苓作为常用中药，对不同煎煮时间传统汤剂中多糖含量的考察在临床用药中有着较重要的意义。通过本实验的初步探索可知，茯苓片水煎液中茯苓多糖与茯苓块水煎液相比无明显差异，且茯苓饮片在煎煮45 min时水煎液中茯苓多糖的含量最高。因此，在临床上，茯苓块和茯苓片均可作为茯苓饮片的常用规格使用；另一方面，在日常煎药时，可在不影响其他药材有效成分煎出的前提下适当增加煎煮时间。