NaHS 引发提高裸燕麦种子活力的生理机制

刘建新，刘瑞瑞，贾海燕，卜婷，李娜

（甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室，陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000）

裸燕麦（Avena nuda）也称莜麦，是起源于中国的一种禾本科燕麦属一年生粮饲兼用作物，其栽培历史已有两千多年，在我国内蒙古、河北和山西等北方地区广泛种植，播种面积仅次于小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）和玉米（Zea mays）［1］。裸燕麦籽粒的蛋白质含量高达15.6%，脂肪含量达3.1%～11.6%，远高于小麦、水稻、玉米和荞麦（Fagopyrum esculentum）；其富含膳食纤维、黄酮和皂苷等营养保健成分［2］，具有降低血糖、血压和血清胆固醇及改善胃肠功能的作用［3］。由于裸燕麦籽粒油脂含量高，且油脂中不饱和脂肪酸达80%以上［1］，所以油脂酸败容易导致种子发生劣变，从而降低种子活力。因此，研究提高裸燕麦种子活力的技术途径对种质资源保存利用及提高播种质量具有重要意义。

种子引发（seed priming）是控制种子缓慢吸水并回干的一项播前种子处理技术［4］，在1973 年由Heydecker等［5］提出，它通过控制种子缓慢吸水让种子停留在吸胀阶段，使种子处于预发芽的状态，但胚根不会突破种皮。目前采用的种子引发技术主要有固体基质引发、生物引发、膜引发和液体引发等［6］。研究证明，引发不仅能提高种子萌发率［7］，使出苗率提高和出苗整齐［8］，而且还可增强种子和幼苗抵抗低温［9］、水分胁迫［10］和盐胁迫［11］等各种逆境的能力。目前应用较多的引发剂主要有FeSO4、PEG-6000、KNO3、GA3、多胺、茉莉酸甲酯、褪黑素和CaCl2等溶液［4，6−11］，而以细胞气体信使分子供体为引发剂进行种子引发的研究还少见报道。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是继NO 和CO 之后在植物体内发现的第3 种气体信号分子，它参与植物生长发育和生理代谢过程调控［12］。已有研究表明，外源H2S 能够促进小麦种子萌发［13］；缓解干旱对水稻种子萌发的抑制［14］；提高盐胁迫下苜蓿（Medicago sativa）萌发种子抗氧化酶活性［15］和番茄（Lycopersicon esculentum）种子活力［16］。那么，以外源H2S 供体硫氢化钠（NaHS）作为引发剂进行种子引发能否提高作物种子活力，以及相关的引发机制研究迄今未见报道。本研究以裸燕麦为材料，使用NaHS 进行种子引发，了解其对种子活力的影响，比较NaHS 引发种子与未引发种子在储藏物质及抗氧化系统等方面的差异，揭示NaHS 种子引发的生理机理，为外源H2S 进行种子引发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验于2019 年4−6 月在甘肃省高校陇东生物资源保护与利用省级重点实验室内进行。供试裸燕麦品种为‘定莜9 号’，种子由甘肃省定西市农业科学研究院提供。H2S 供体NaHS 购自Sigma−Aldrich 公司，其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 试验设计

1.2.1 NaHS 引发处理 挑选大小均一的裸燕麦健康种子约10 g 置于100 mL 烧杯中，分别加入0、50、100、200、400、800、1600 μmol·L−1NaHS 溶液，种子重量与溶液体积比为1︰3（g︰mL），在20 ℃避光引发18 h，蒸馏水洗净残余NaHS 后用吸水纸吸干表面水分，在室温下回干至初始含水量7.3%时的重量后装入磨口瓶中于冰箱中4 ℃保存备用。以未引发的裸燕麦种子（含水量7.3%）作对照（CK）一同进行发芽试验，筛选NaHS 引发浓度。以筛选的800 μmol·L−1NaHS 溶液分别引发裸燕麦种子6、9、12、15、18 和21 h，蒸馏水冲洗后室温回干至种子初始含水量（7.3%），然后进行发芽试验，筛选NaHS 引发时间。试验重复5 次。

用800 μmol·L−1NaHS 溶液20 ℃避光引发18 h，蒸馏水清洗后室温回干至初始含水量（7.3%）的裸燕麦种子作为NaHS 引发种子；以蒸馏水（H2O）引发的种子作为NaHS 引发种子的阳性对照，排除H2O 的影响；以未引发的种子作为阴性对照（CK）。将NaHS 引发、H2O 引发和CK 种子4 ℃保存，立刻直接用于各项生理指标测定。每个处理5 次重复。

1.2.2 种子萌发指标测定 参照国家标准农作物种子检验规程GB/T3543.4-1995［17］，将不同浓度NaHS 引发和NaHS 引发不同时间处理的种子分别均匀摆放在铺有两层滤纸的培养皿（直径120 mm）中，每皿放置100 粒，各加5 mL 蒸馏水后在培养箱（LPGZ-250A，无锡莱浦仪器设置有限公司）中20 ℃、14 h/10 h（光/暗）培养。在种子置床后每12 h 观察1 次，以胚根突破种皮2 mm 为发芽标准，记录种子发芽数，每次观察时补充适量蒸馏水，共观察6 d。发芽结束后将幼苗在105 ℃杀青30 min 后65 ℃烘干至恒重称量干重，计算发芽势（germination poten⁃tial，GP）、发芽率（germination rate，GR）、发芽指数（germination index，GI）、活力指数（vigor index，VI）和幼苗单株干重（dry weight，DW）。GP（%）=前3 d 发芽种子数/供试种子数×100；GR（%）=发芽结束后的发芽种子数/供试种子数×100；GI=∑（Gt/Dt），Gt为第t 天的种子发芽数，Dt为相应的发芽天数；VI=GI×DW。

1.2.3 引发种子生理指标测定 采用亚甲基蓝法测定H2S 含量［18］；采用α-萘胺显色法测定超氧阴离子（O2·ˉ）含量，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，采用电导率仪法测定质膜相对透性（rela⁃tive permeability of plasma membrane，RPPM）［19］；按Sergiev 等［20］的方法测定H2O2含量；按陈建勋等［21］的方法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。按杨颖丽等［22］的方法测定还原型抗坏血酸（reduced ascorbic acid，ASA）、脱氢抗坏血酸（dehydroascorbic acid，DHA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）含量。采用高俊凤［19］的分光光度法、3，5-二硝基水杨酸显色法、蒽酮比色法和考马斯亮蓝染色法分别测定细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，COX）和淀粉酶活性及淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白质含量。

1.3 数据统计与分析

用SPSS 20.0 对数据进行单因素方差分析，对百分率数据反正弦转换后进行方差分析，采用Duncan 法多重比较（P<0.05），数据结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaHS 引发对裸燕麦种子活力的影响

从表1 可见，与不引发的CK 相比，不同浓度NaHS 引发对裸燕麦种子的发芽指标影响不同。其中800 μmol·L−1NaHS 引发显著提高了GP、GR、GI 和VI，但对DW 的影响不大。另外，除100 μmol·L−1NaHS 引发显著提高了GR、200 μmol·L−1NaHS 引发显著提高了GI 外，其他各浓度NaHS 引发的GP、GR、GI、VI 和DW 均与CK 的差异不显著。因此，选用800 μmol·L−1作为后续试验NaHS 的引发浓度。

2.2 NaHS 不同引发时间对裸燕麦种子活力的影响

从800 μmol·L−1NaHS 引发不同时间对裸燕麦种子发芽指标的影响可以看出（表2），除引发21 h 的GP 显著高于12 h、引发12 h 的GR 显著低于引发15、18 和21 h 外，其他各引发时间的GP 和GR 无显著差异；除引发18 和21 h 的GI、VI 显著高于引发6、9、12 和15 h 外，其他各引发时间的GI 和VI 差异不显著；不同引发时间的DW 差异均不显著。由于引发18 h 的GI 和VI 显著高于引发6 ～15 h 的GI 和VI，且GP、GR 和DW 相对较大，并与引发21 h 的GP、GR、GI、VI 和DW 无显著差异，所以选用引发18 h 作为NaHS 引发时间。

表1 不同浓度NaHS 引发对裸燕麦种子发芽指标的影响Table 1 Effect of seed priming with different concentrations of NaHS on germination indexes of naked oat

表2 用800 µmol·L-1 NaHS 引发不同时间对裸燕麦种子发芽指标的影响Table 2 Effect of 800 µmol·L-1 NaHS priming times on germination indexes of naked oat seeds

2.3 NaHS 引发对裸燕麦种子贮藏物质含量的影响

表3 表明，与CK 相比，NaHS 和H2O 引发均未显著改变裸燕麦种子淀粉和可溶性蛋白质含量；H2O 引发显著降低了种子可溶性糖含量，NaHS 引发的种子可溶性糖含量与CK 和H2O 引发无显著差异。

2.4 NaHS 引发对裸燕麦种子细胞色素氧化酶和淀粉酶活性的影响

细胞色素氧化酶（COX）是电子传递链末端酶，淀粉酶是催化淀粉水解的关键酶。表4 表明，NaHS 引发显著提高了裸燕麦种子的COX 活性，分别比CK 和H2O 引发提高了103.3%和19.4%，H2O 引发的COX活性比CK 提高了70.3%，且差异显著。与CK 相比，NaHS 和H2O 引发均显著降低了α-淀粉酶、β-淀粉酶和（α+β）淀粉酶活性，α-淀粉酶活性分别降低了53.6%和43.9%，β-淀粉酶活性分别降低了39.8%和16.4%，（α+β）淀粉酶活性分别降低了40.1%和17.1%。NaHS 引发与H2O 引发相比，α-淀粉酶活性无显著差异，β-淀粉酶和（α+β）淀粉酶活性分别下降了27.9%和27.7%，且差异显著。

表3 不同引发剂对裸燕麦种子淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白质含量的影响Table 3 Effect of seed priming with different agents on the contents of starch，soluble sugar and soluble protein of naked oat seeds（mg·g-1）

表4 不同引发剂对裸燕麦种子细胞色素氧化酶和淀粉酶活性的影响Table 4 Effect of seed priming with different agents on the activities of cytochrome oxidase and amylase of naked oat seeds

2.5 NaHS 引发对裸燕麦种子H2S 含量、活性氧产生和膜脂过氧化的影响

由表5 可见，NaHS 引发显著提高了裸燕麦种子中H2S 的含量，比CK 提高了113.5%，比H2O 引发提高了79.7%，而H2O 引发种子的H2S 含量与CK 差异不显著。NaHS 引发显著降低了O2·ˉ、H2O2、MDA 含量和RPPM，分别比CK 下降了34.7%、36.1%、37.6%和11.9%，比H2O 引发分别下降了11.7%、22.6%、29.0%和7.3%；与CK 相比，H2O 引发显著降低了O2·ˉ含量和RPPM，分别下降了26.0%和4.6%，而对H2O2和MDA 含量无显著影响。

表5 不同引发剂对裸燕麦种子H2S、O2·ˉ、H2O2、MDA 含量和质膜相对透性的影响Table 5 Effect of seed priming with different agents on contents of H2S，O2·ˉ，H2O2，MDA and RPPM of naked oat seeds

2.6 NaHS 引发对裸燕麦种子抗氧化酶活性的影响

由表6 可知，NaHS 引发显著提高了裸燕麦种子SOD、CAT 和POD 活性，分别比CK 提高了6.1%、112.0%和120.5%，比H2O 引发分别提高了6.2%、85.8%和63.7%，而其APX 活性与CK 和H2O 引发的差异不显著。与CK 相比，H2O 引发对SOD 和CAT 活性无显著影响，但POD 和APX 活性分别显著提高了34.7%和49.1%。

表6 不同引发剂对裸燕麦种子SOD、CAT、POD 和APX 活性的影响Table 6 Effect of seed priming with different agents on activities of SOD，CAT，POD and APX of naked oat seeds

2.7 NaHS 引发对裸燕麦种子抗氧化物质含量的影响

由表7 可知，NaHS 引发的裸燕麦种子中ASA、DHA 含量和ASA/DHA 均与CK 和H2O 引发的无显著差异，却显著降低了GSH 含量和GSH/GSSG，分别比CK 下降了29.2%和38.1%，GSSG 含量却比CK 显著提高了14.4%。NaHS 引发的种子GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG 与H2O 引发的差异不显著。

表7 不同引发剂对裸燕麦种子抗氧化物质含量的影响Table 7 Effect of seed priming with different agents on the antioxidant contents of naked oat seeds

3 讨论

引发是作物播前种子预处理的一项重要措施。研究证明，引发能够增强种子活力和提高幼苗抗逆性［7−11］。研究者通常用发芽势（GP）、发芽率（GR）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）等发芽指标反映引发种子的活力状况［11］。GP 反映种子发芽速率；GR 反映在一定时间内总的种子发芽百分率；GI 既能反映发芽速率，又能反映发芽的整齐程度；VI 是发芽速率和生长量的综合反映，是衡量种子活力更好的指标［23］。现有的种子引发研究多用低渗透势高分子物质或小分子渗透物质作为引发剂［4，6−11］，以外源信号分子供体作引发剂进行种子引发的研究尚鲜见报道。本研究发现，用800 μmol·L−1外源H2S 供体NaHS 作为引发剂引发18 h 显著提高了裸燕麦种子的GP、GR、GI 和VI，但对幼苗生长量的影响不大（表1 和表2）。这与Zhang 等［13］用NaHS 预处理12 h 可促进小麦种子萌发的结果类似。说明用气体信号H2S 供体引发可提高裸燕麦的种子活力。

关于种子引发机理的研究大多从引发种子萌发苗生理生化的变化进行探讨，通过引发种子内部变化揭示引发生理机制的研究尚鲜见报道［4］。种子引发通常是种子在低水势溶液中缓慢吸水后再回干至初始状态的过程，这个过程中可能会使种子内部的相容性溶质（compatible solutes）如脯氨酸、甜菜碱和可溶性糖等含量发生改变。阮松林等［24］研究表明，用脯氨酸和NaCl 引发可提高水稻种子脯氨酸和蔗糖含量，而降低果糖和可溶性糖含量。牛晓雪等［4］发现，FeSO4引发能够降低秦艽（Gentiana macrophylla）种子中蔗糖和可溶性蛋白质含量，对淀粉、葡萄糖和果糖含量无影响。本研究中，用NaHS 引发并未引起裸燕麦种子中淀粉、可溶性糖和可溶性蛋白质含量的显著变化（表3）。这与王彦荣等［7］用PEG 引发紫花苜蓿和沙打旺（Astragalus adsurgens）种子在萌发吸水初始阶段可溶性糖和脯氨酸含量无显著变化的结果类似。说明NaHS 引发并不是通过提前启动物质代谢来增强裸燕麦的种子活力。进一步研究发现，NaHS 引发显著降低裸燕麦种子中α-淀粉酶、β-淀粉酶和总淀粉酶活性（表4）。这与前人NaHS 处理可提高小麦种子胚乳β-淀粉酶活性，而对α-淀粉酶合成和活性没有影响的结果［13］有区别。这可能与不同植物种类响应机制存在差异有关。淀粉酶是一类催化种子贮藏淀粉水解成小分子糖的关键酶。有研究表明，H2S 参与植物体内关键半胱氨酸（cysteine，Cys）残基的巯基化修饰，从而调节蛋白质的活性［18］。本研究中，NaHS 引发显著提高了裸燕麦种子中H2S 的含量（表5）。NaHS 引发抑制裸燕麦种子淀粉酶活性的原因可能与H2S 参与Cys 残基的巯基化修饰有关。因为引发是种子缓慢吸水后仍让种子回干至原来状态的过程，并未让种子处于萌发阶段。这时H2S 可能通过修饰抑制淀粉酶的活性，不让种子启动萌发。本研究中NaHS 引发未引起裸燕麦种子贮藏物质含量变化的结果与此相互佐证，进一步证明NaHS 引发并非通过贮藏物质动员来提高种子活力。但NaHS 引发抑制淀粉酶活性的具体机制有待进一步揭示。线粒体是细胞物质和能量代谢的场所，其内膜上的COX 活性反应细胞有氧代谢的水平［25］。本研究中，NaHS 引发显著提高了裸燕麦种子中的COX 活性（表4）。这与用FeSO4引发提高秦艽种子COX 活性的结果相一致［4］。由此认为，NaHS 引发增强线粒体呼吸代谢水平可能是提高种子活力的生理调节机制之一。若线粒体有氧呼吸水平降低，便会产生呼吸链电子泄漏，导致活性氧积累造成线粒体结构破坏［25］。本研究结果显示，NaHS 引发能显著降低裸燕麦种子中2 种主要活性氧（O2·ˉ、H2O2）的含量，也使细胞膜脂过氧化产物MDA 含量和RPPM 明显下降（表5），说明NaHS 引发可通过降低活性氧水平维持细胞结构和功能的完整性。这与王彦荣等［7］和杨小环等［26］的引发可促进种子细胞膜修复，降低内容物外渗的研究结果一致。

引发本身对种子就是一种胁迫，能够诱导细胞防御体系的建立［4］。植物体内的抗氧化防御系统在维持活性氧代谢平衡、防止膜脂氧化损伤方面发挥着重要作用［14］。抗氧化系统包括酶系统和抗氧化物质，其中SOD 催化O2·ˉ发生歧化反应产生H2O2，H2O2进一步被CAT、POD 和APX 协同转化成H2O［16］；ASA 和GSH 则通过ASA−GSH 循环参与H2O2的清除［22］。本研究结果发现，NaHS 引发显著提高裸燕麦种子中的SOD、CAT 和POD 活性，降低GSH 含量和GSH/GSSG，而对APX 活性及ASA、DHA 含量和ASA/DHA 的影响不大（表6 和表7）。由此认为，NaHS 引发主要通过提高SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶活性来维持裸燕麦种子较低水平的活性氧，从而降低对膜脂的氧化伤害程度，提高种子活力。这与外源NaHS 处理提高抗氧化酶活性缓解盐胁迫对番茄种子萌发抑制［16］的结果基本一致。本研究中，NaHS 引发引起裸燕麦种子GSH/GSSG 降低的原因可能是引发促进了种子中已有GSH 参与了活性氧清除而被氧化成GSSG，进而通过ASA−GSH 循环维持了ASA/DHA 的稳定（表7）。由于ASA/DHA 相对稳定，NaHS 引发可能对APX 活性也表现为无显著的影响（表6），但NaHS 引发激活SOD、CAT 和POD 活性的机制以及对ASA−GSH 循环相关酶系的调节作用尚待进一步探究。

4 结论

用800 μmol·L−1NaHS 引发18 h 可以提高裸燕麦的种子活力。NaHS 引发提高裸燕麦种子活力的可能生理机制：一是引发提高种子内H2S 含量，进而诱导SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶活性提高，通过GSH 氧化成GSSG 维持ASA/DHA 和APX 活性的相对稳定，从而有效清除O2·ˉ和H2O2等活性氧，使膜脂过氧化程度保持在较低水平；二是通过激活线粒体COX 活性，增强细胞有氧呼吸代谢水平，从而提高种子活力。NaHS 引发并非通过激活淀粉酶活性提前启动淀粉等贮藏物质转化而提高裸燕麦种子活力。