日粮不同NDF/NFC 水平对周岁后荷斯坦奶牛生产性能、营养物质消化率、瘤胃发酵特征和甲烷排放的影响

董利锋，杨修竹，高彦华，李斌昌，王贝，刁其玉

（1.中国农业科学院饲料研究所，反刍动物及其幼畜营养代谢中美联合研究中心，中国农业科学院-国际热带农业研究中心农业可持续发展联合实验室，北京100081；2.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都610041；3.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州730070；4.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔843300）

反刍动物凭借其庞大的瘤胃微生物体系能够高效利用纤维类物质含量丰富的粗饲料，并将其转化为动物性产品。在瘤胃微生物发酵过程中，产甲烷菌利用微生物降解过程中所产生的底物（如H2）生成甲烷。作为瘤胃有机物无氧酵解的必然副产物之一，甲烷气体排放所损失的能量可占到饲料总能摄入量的2.7%～9.8%［1］。以往的研究发现，增加日粮中粗纤维水平可显著降低反刍动物的干物质采食量和营养物质消化率，会促进瘤胃发酵甲烷的产生［2］。Moorby 等［3］发现将荷斯坦泌乳奶牛日粮中中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）含量从41%增加到55%时，其干物质采食量和中性洗涤纤维采食量分别下降了56.8%和18.3%。周艳等［4］在生长期杜寒杂交肉羊上的结果发现，当饲料中NDF 含量增加时，干物质的表观消化率从61.34%降低至51.17%，粗蛋白质的表观消化率从47.47%下降至30.95%，而甲烷产量从36.07 L·d−1增加至79.32 L·d−1。原因可能是瘤胃内食糜的消化速度和流通速率受到了日粮结构的影响，从而造成瘤胃甲烷排放量的改变。除此之外，畜牧养殖业产生的甲烷是人为排放甲烷的重要来源之一，是造成全球性极端气候变化的主要贡献者。因此，适当减少反刍动物甲烷的生成和排放具有经济和环境的双重效益。

作为奶牛种群中的主体，泌乳奶牛在不同生产模式和日粮条件下的瘤胃甲烷排放特征已经得到较为广泛的研究和证明。王贝等［5−7］系统研究了荷斯坦泌乳奶牛在不同泌乳阶段的瘤胃甲烷排放规律，结果发现泌乳中期的甲烷排放量最高（399.8 g·d−1），其次是泌乳后期（395.61 g·d−1）和泌乳早期（391.86 g·d−1）。Jonker 等［8］发现荷斯坦泌乳奶牛在不同放牧条件下瘤胃甲烷排放量存在差异，其中奶牛在燕麦草（Lolium perenne）和白三叶草（Trifolium repens）牧场中甲烷排放量为402 g·d−1。郜宇洋［9］采用六氟化硫示踪技术研究了不同生长阶段西门塔尔杂交肉牛营养物质利用和瘤胃甲烷排放，发现随着生长阶段的递增，甲烷排放量逐渐增加。近期的研究发现，与饲喂50%粗饲料的荷斯坦后备奶牛相比，饲喂70%粗饲料的奶牛的瘤胃甲烷排放量显著增加了20.8%，甲烷转化因子增加了43.9%［10］。Jiao 等［11］研究了舍饲条件下荷斯坦后备奶牛瘤胃甲烷的排放特征，发现生理阶段（6、12、18 和22 月龄）和性别（公母）能够显著影响甲烷排放量。但是，目前我国关于后备奶牛瘤胃甲烷排放特征的研究较少，尤其是不同日粮营养组成和结构条件下后备奶牛的生长性能、营养物质消化率、瘤胃发酵特征以及甲烷排放的研究还存在空白，仍缺乏系统性的甲烷排放规律和甲烷转化因子的研究。因此，本试验通过研究不同日粮中性洗涤纤维/非纤维性碳水化合物（neutral detergent fiber/non-fibrous carbohydrate，NDF/NFC）水平对周岁后荷斯坦奶牛生产性能、营养物质表观消化率、瘤胃发酵指标及甲烷产量的影响，并在此基础上建立瘤胃甲烷排放预测模型，旨在获得我国生产模型下的甲烷排放规律和甲烷转化因子，为提高奶牛能量利用效率和探索减排策略提供科学依据和支撑。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

本试验于2018 年9−10 月在北京市房山区赵营村中加永宏奶牛场完成。

1.2 试验设计与管理

试验选用45 头体重为（425±35.2）kg，月龄为（14.5±0.34）体况健康的中国荷斯坦后备奶牛。根据月龄、体重相近的原则按照单因素实验设计将动物随机分为3 个处理组：低NDF/NFC 组（NDF/NFC=0.60；精料比例为50%，干物质基础）、中NDF/NFC组（NDF/NFC=0.75；精料比例为40%）以及高NDF/NFC 组（NDF/NFC=0.90；精 饲 料 比 例 为30%）。按照中国奶牛饲养标准［12］配置后备奶牛的日粮，日粮组成及营养成分含量见表1。试验预饲期为14 d，正式试验期为56 d，包括35 d 的生长试验，7 d 的消化代谢试验以及14 d 的气体代谢试验。试验奶牛采用拴系式饲养，每天喂料2 次（06：00 和18：00），日剩料量控制在5%。自由饮水，定期清理水槽，保证清洁饮水。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能测定 干物质采食量的测定。分别于生长试验的第1、3 和5 周连续4 d 记录每天每头奶牛的投料量和剩料量，计算每头奶牛的日采食量。根据采食量记录期间采集的饲料样品的干物质含量来计算奶牛每天的干物质采食量。

体重和平均日增重的测定。分别于生长试验的第1、21 和35 天晨饲前进行称重，并计算平均日增重。

1.3.2 营养物质表观消化率测定 采用盐酸不溶灰分法（acid insoluble ash）测定后备奶牛的营养物质表观消化率［13］。在正式试验期的第36～42 天分批次连续收集粪便样品7 d。采样时按照每100 g 鲜样加10 mL 盐酸（10%浓度）防止氮的挥发。经65 ℃烘箱中烘干后密封保存。

1.3.3 瘤胃液采集与发酵指标测定 于正式试验结束前3 d，从每个处理组中随机选取4 头动物，晨饲前采用口腔导管的方式采集瘤胃液样品［14］。采集的瘤胃液用灭菌的4 层纱布过滤后分装于10 mL 的离心管中用于挥发性脂肪酸和氨态氮浓度测定。另取10 mL 的瘤胃液进行pH 值测定。

表1 日粮基本组成及营养成分含量Table 1 The composition and nutrient contents of experi⁃mental diet

参照Broderick 等［15］的水杨酸钠−次氯酸钠比色法测定瘤胃液氨态氮（NH3−N）含量。采用气相色谱仪（6890N，Agilent，美国）测定挥发性脂肪酸的浓度。色谱柱为HP19091N−213 型毛细管柱，进样口温度为200 ℃，载气为高纯氮气，流量为2.0 mL·min−1。火焰氢离子检测器的温度为250 ℃［16］。酸碱度采用便携式pH 计（ST 300，Ohaus，美国）测定。

1.3.4 瘤胃甲烷排放测定 采用六氟化硫示踪技术测定荷斯坦后备奶牛的瘤胃甲烷排放量［17］。在气体代谢试验开始前3 d，从每个处理组中随机选取5 头后备奶牛，采用兽用投药枪（A28568N，科立博，武汉）将六氟化硫渗透管投入到瘤胃内，并连接气体采集管路、集气罐和背部衬垫，以便让动物充分适应设备。本试验中六氟化硫渗透管的渗透速率范围为3.42～3.85 mg·d−1，平均渗透速率为3.35 mg·d−1。气体采集管路中的流速控制为0.45 mL·min−1，集气罐体积为4.5 L。

气体代谢试验期间，连续收集每个处理组中5 头动物每天24 h 的气体产量（08：00 至次日08：00）。同时，选取5 个采气管路和集气罐放置于牛舍内对背景气体进行采集。气体样品采集结束后对集气瓶内压力进行测定，大于−40 kPa 时即为采样成功。采用气相色谱仪（GC-126，上海仪电分析仪器有限公司，上海）对每日采集的气体样品进行测定。其中氢火焰离子检测器和电子捕获检测器的检测温度分别为150 和300 ℃。六氟化硫和甲烷标准气体的浓度分别为6.5×10−8和7.1×10−3g·m−3，填充气为高纯氮气。采用单点校正法测定六氟化硫含量，并计算甲烷浓度，单位以g·d−1表示。

1.3.5 饲料样品采集与分析 于正试期的第12～15 天连续收集各处理组的饲料样品，充分混合后进行常规营养价值成分的分析。依照张丽英［18］的方法对饲料样品中的有机物、粗蛋白质、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、粗脂肪、粗灰分、总能、钙和磷进行测定，并计算日粮中NFC 的含量。同时，采用相同方法测定粪样中粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，计算营养物质的表观消化率。

1.4 统计分析

采用SPSS 22.0 软件进行单因素方差分析，采用Duncan 氏法进行差异显著性分析。试验结果以P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛生长性能的影响

如表2 所示，3 组动物的月龄和体重没有显著差异（P>0.05）。低NDF/NFC 组后备奶牛的干物质采食量、有机物采食量和总能摄入量显著高于另外两个处理组（P<0.05）。低NDF/NFC 组和中NDF/NFC 组动物的平均日增重没有显著差异（P>0.05），但显著高于高NDF/NFC 处理组（P<0.05）。

2.2 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛营养物质表观消化率的影响

如图1 所示，在消化代谢试验中，低NDF/NFC 组的干物质、粗蛋白质和酸性洗涤纤维表观消化率显著高于中NDF/NFC 和高NDF/NFC 组（P<0.05），但后两个处理组在该指标上没有显著差异（P>0.05）。对于中性洗涤纤维表观消化率来说，低NDF/NFC 和中NDF/NFC 组之间没有显著差异（P>0.05），但显著高于高NDF/NFC 组（P<0.05）。

2.3 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛瘤胃发酵指标的影响

如表3 所示，3 个处理组中试验动物的瘤胃pH 值之间没有显著差异（P<0.05）。但是，随着日粮NDF/NFC水平的增加，瘤胃内总挥发性脂肪酸的浓度、乙酸相对含量以及乙酸/丙酸的比例显著增加（P<0.05），而丙酸和丁酸的相对含量显著降低（P<0.05）。此外，戊酸、异戊酸和异丁酸的含量在3 个处理组中没有显著差异（P>0.05）。

2.4 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛瘤胃甲烷排放的影响

如表4 所示，甲烷的排放量与日粮中NDF/NFC 水平紧密相关，高的NDF/NFC 水平，甲烷排放就高（P<0.05）。高NDF/NFC 组后备奶牛的单位代谢体重、单位干物质采食量、单位有机物采食量、单位中性洗涤纤维采食量的甲烷排放量显著高于另外两个处理组（P<0.05）。单位总能摄入量的甲烷能排放量也随着日粮NDF/NFC 水平的增加而显著增加（P<0.05）。

表2 日粮不同NDF/NFC 水平对荷斯坦后备奶牛生产性能的影响Table 2 Effects of dietary NDF/NFC contents on the growth performance of Holstein heifers

图1 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛营养物质表观消化率的影响Fig.1 Effects of different dietary NDF/NFC levels on nutrient digestibility of heifers

2.5 后备奶牛瘤胃甲烷排放预测模型

如表5 所示，基于动物体重、干物质采食量、中性洗涤纤维含量以及非纤维性碳水化合物含量/中性洗涤纤维含量分别建立了瘤胃甲烷产量的预测模型。其中基于干物质采食量建立的甲烷预测模型的决定系数最高，为0.74。另外，基于总能摄入量、中性洗涤纤维采食量、非纤维性碳水化合物采食量也建立了甲烷能产量的预测模型。基于干物质采食量和中性洗涤纤维采食量建立的二元一次预测模型提高了方程的决定系数，达到了0.77。

表3 日粮不同NDF/NFC 水平对荷斯坦后备奶牛瘤胃发酵指标的影响Table 3 Effects of dietary NDF/NFC contents on the ruminal fermentation parameters of Holstein heifers

表4 日粮不同NDF/NFC 水平对荷斯坦后备奶牛瘤胃甲烷产量的影响Table 4 Effects of dietary NDF/NFC contents on the enteric methane emissions of Holstein heifers

表5 基于生产性能和营养物质摄入量的瘤胃甲烷产量预测模型Table 5 Prediction equations of enteric methane emissions based on production performance，nutrient content and intake pa⁃rameters

3 讨论

3.1 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛生长性能的影响

后备牛的生长性能与日粮营养水平密切相关。本研究发现提高日粮中可溶性碳水化合物的含量可显著提高动物的干物质采食量和日增重，该结论与王贝等［7］的结果一致，主要原因是日粮中非纤维性碳水化合物如淀粉含量增加，经瘤胃微生物发酵之后，动物可获得更多的能量，因此能够提高动物的日增重。此外，淀粉等可溶性碳水化合物增加，使食糜在瘤胃内的流通速度增加，停留时间减少，因此动物通过增加采食次数和采食量来提高饱腹感。在本试验中，与高NDF/NFC 组的后备奶牛相比，低NDF/NFC 的干物质采食量和非纤维性碳水化合物采食量分别提高了6.99%和7.84%，平均日增重显著提高了20.7%。结果表明提高日粮中的非纤维性碳水化合物比例可以提高生长性能，有利于动物生长发育。

3.2 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛营养物质表观消化率的影响

日粮中NDF/NFC 的比例可在一定程度上反映出饲料中难降解物质和易消化物质的组成，影响其在瘤胃内的降解速率、降解产物，并进一步改变瘤胃的发酵模式。因此，日粮中纤维类物质和非纤维性碳水化合物能够显著改变营养物质在瘤胃内的表观消化率。以往的研究表明，当日粮精料水平低于70%时，增加日粮精料含量总能提高干物质和有机物的表观消化率［4］。究其原因，可能是随着日粮中精料比例增加，可溶性碳水化合物含量增加，发酵产生的营养物质可为瘤胃微生物提供更多的能量，增加其消化代谢营养物质的活性。本试验中，当后备奶牛饲喂低NDF/NFC 日粮时，其干物质的表观消化率比高NDF/NFC 组提高了10.1%，而中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维分别提高了4.9%和8.3%，达到了显著水平。该结论与周艳等［4］在生长期母羊上的结果一致。以往的研究认为精饲料比例能够显著影响瘤胃微生物对氮的利用效率，而适度提高日粮淀粉含量可促进蛋白质的消化，并增强瘤胃微生物对含氮物质的利用［19］。本试验中降低日粮中NDF/NFC 比例时，粗蛋白质的表观消化率最多提高了9.5%，该结论与以上研究结果一致。

3.3 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛瘤胃发酵指标的影响

日粮结构和组成是影响瘤胃发酵特征的重要因素之一，其中瘤胃液pH 值能够反映瘤胃内有机酸和氨态氮等碱性物质的动态平衡关系。在本试验中，3 个处理组中瘤胃液的pH 值之间没有显著差异，表明本试验中日粮对瘤胃酸碱度的影响较小。与以往的研究结果一致，3 个处理组瘤胃液的平均pH 值为6.45，在正常的pH 值范围之内（5.5～7.5）［20］。瘤胃液中氨态氮是食糜中含氮类物质代谢的重要产物，也是瘤胃微生物蛋白质合成的主要氮源。有研究表明，瘤胃液中氨态氮的含量与日粮中粗蛋白质含量呈正相关关系；但提高日粮中碳水化合物水平会抑制瘤胃微生物对蛋白质的降解，从而造成氨态氮含量的累积［21］。在本试验中，将周岁后荷斯坦后备奶牛日粮NDF/NFC 水平由0.6 增加至0.9 时，瘤胃内氨态氮含量并没有发生显著变化，原因可能与发酵底物的能氮比例、瘤胃微生物的组成和活性等因素有关［22］。另外，本试验中3 个处理组的蛋白质水平之间差异较小也可能是造成瘤胃氨态氮含量比较稳定的原因。与赵娜等［23］的结论一致，氨态氮浓度是日粮中蛋白降解和合成之间的平衡状况的结果，除了瘤胃内碳水化合物含量的影响之外，氨态氮的含量也主要受到氮利用效率的影响。本试验中，提高日粮中NDF/NFC 比例显著增加了瘤胃内总挥发性脂肪酸产量、乙酸相对含量和乙酸/丙酸的比例。Murphy等［24］研究发现将奶牛日粮中粗饲料的比例由30%增加至50%时，其瘤胃内乙酸的相对含量从61.5%增加至64.4%，乙酸/丙酸的比例从3.33 增加至3.63，而丙酸的产量从25.2 下降至22.3 mmol·L−1。同样的，Kljak 等［21］在后备牛的研究中发现当日粮粗饲料从85%降低至55%时，瘤胃内乙酸含量下降了3.25%，乙酸/丙酸比例下降了6.68%，而丙酸的含量上升了3.37%。以上结果表明，提高日粮中纤维类物质含量能够使瘤胃发酵类型由丙酸型发酵转向乙酸型发酵，促进乙酸生成的同时降低丙酸产量，从而影响瘤胃内甲烷的产生［25−26］。

3.4 日粮不同NDF/NFC 水平对后备奶牛瘤胃甲烷排放的影响

反刍动物瘤胃甲烷是饲料有机物在瘤胃内经微生物的降解作用产生的必然副产物。以往的研究发现，除了动物品种及其遗传特性之外，日粮组成和结构是影响瘤胃甲烷产生的重要因素［27］。本试验中，日粮的NDF/NFC水平从0.60 增加至0.90 时，甲烷和甲烷能的产量显著增加，而且甲烷排放强度（甲烷/干物质采食量、甲烷/有机物采食量、甲烷/中性洗涤纤维采食量）也显著增加。原因可能是，随着饲料中NDF/NFC 比值的提高，瘤胃发酵产生乙酸和丁酸含量增加的同时氢气产量不断增加，这些氢气作为产甲烷的重要底物，被不断利用生成甲烷。而饲料中可溶性碳水化合物的含量增加，能够使瘤胃发酵类型向丙酸型转变，底物氢气的产生量减少，从而降低甲烷排放［28］。本试验中，日粮的NDF/NFC 水平从0.60 增加至0.90 时，乙酸的相对含量增加了6.0%，而丙酸的相对含量下降了28.1%。而乙酸/丙酸的值相应增加了26.6%，从而造成瘤胃甲烷产量增加了13.3%。王增林等［29］的体外试验结果发现24 h 甲烷产量与乙酸/丙酸呈显著正相关。有研究认为，单位纤维素发酵产生的甲烷是半纤维素的3 倍，是可溶性残余物的5 倍，而源于纤维类物质的甲烷排放是可溶性碳水化合物的3 倍以上［30］。与此同时，饲料中非纤维性碳水化合物含量的增加会降低瘤胃内原虫、纤维素分解菌和产甲烷菌的活性，从而降低甲烷排放［31］。而纤维类物质含量的增加可促进原虫的丰度，通过产甲烷菌与原虫之间的氢传递作用，有效利用底物氢气，促进甲烷的排放［32］。此外，甲烷能/总能摄入量作为甲烷转化因子常用来计算国家或地区内反刍动物的温室气体排放清单。由于目前缺乏基本的我国养殖模式特征的甲烷转化因子，IPCC［33］常采用固定的甲烷转化因子（6.5%）来计算我国泌乳奶牛和后备奶牛的瘤胃甲烷排放量。本研究发现，随着日粮中NDF/NFC 比例的增加，后备奶牛的甲烷排放因子为动态的变化值，分别为5.68%，6.65%和7.69%。Niu 等［1］收集了5233 头奶牛瘤胃甲烷的排放数据，发现泌乳奶牛甲烷转化因子的范围为2.7%～9.8%，平均值为6.0%，低于IPCC 的推荐值。同时，Morrison 等［17］采用六氟化硫示踪技术发现放牧条件下5～10 月龄、12～17 月龄和18～23 月龄的荷斯坦后备奶牛的甲烷转化因子分别为5.9%、6.9%和6.6%，本试验结果与此相一致。因此，基于本试验建立的后备奶牛甲烷转化因子，可为准确建立我国国家和地区的温室气体排放清单提供科学支撑，为实施减排战略和探索减排措施提供数据支持。

3.5 后备奶牛瘤胃甲烷排放预测模型

尽管多种测定技术和手段能够对反刍动物瘤胃甲烷的排放量进行准确评估，但由于操作步骤、使用技术等方面的限制，越来越多的研究通过基于动物品种、日粮组成和结构等特征来建立瘤胃甲烷排放预测模型。预测模型能够提供准确简便的测定方法，有利于温室气体排放清单和开发减排策略的建立和开发。本试验中，基于干物质采食量建立的预测模型的相关系数为0.74，显著高于基于体重或中性洗涤纤维含量建立的预测模型。该结果与以往的研究一致，即干物质采食量被认为是预测模型中最为重要的指标，原因是采食量直接决定了瘤胃发酵底物的生成，从而影响甲烷的排放。Jiao 等［11］研究了12 月龄荷斯坦后备奶牛瘤胃甲烷排放和干物质采食量之间的相关关系，且决定系数达到了0.76。Ellis 等［34］综述了89 头泌乳奶牛和83 头肉牛的干物质采食量和甲烷排放数据，发现预测模型的决定系数最大可达到0.685。Hristov 等［35］认为尽管不同瘤胃甲烷测定方法之间存在一定的误差，但基于干物质采食量建立的预测模型准确度最高（R2=0.63），而与基于中性洗涤纤维采食量的预测模型则准确度较低，决定系数为0.46。前人的研究发现，与单一的预测指标相比，增加预测模型中的变量数量，可显著提高预测模型的决定系数和预测精度。如，在干物质采食量的基础上增加中性洗涤纤维采食量显著提高了本试验中甲烷预测模型的准确度。Jiao 等［11］研究发现基于干物质采食量和粗饲料比例建立的二元一次预测模型的决定系数能够超过0.90，而基于代谢能摄入量、中性洗涤纤维采食量和粗饲料比例的三元一次模型的决定系数能够超过0.95。也有研究发现，与结合甲烷实测值建立的一元一次或多元一次的甲烷预测模型相比，指数方程和Mitscherlich 方程也能够大幅度提高预测准确度［36］。

4 结论

本研究发现提高日粮中NDF/NFC 水平能够显著降低周岁后荷斯坦奶牛的采食量和营养物质表观消化率，但显著提高了瘤胃内总挥发性脂肪酸和乙酸含量，提高了瘤胃甲烷排放量和甲烷转化因子。基于动物的生产性能、日粮的营养物质含量和摄入量建立的预测模型能够准确反映和评估反刍动物瘤胃的甲烷排放量。