不同产源艾纳香油抗菌活性筛选及其对金黄色葡萄球菌抗菌作用的研究

高 月，王万林，彭俊超，蔡亚玲，廖加美，易 琼，王 鲁*

(1.西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵阳 550025；2.贵州省生化工程中心，贵阳 550025；3.贵州大学 药学院，贵阳 550025)

在日常饲料中添加抗生素类药物，具有防控动物细菌性疾病和促动物生长作用，但抗生素的滥用容易引起细菌的耐药、畜产品的安全及公共卫生等问题，而中兽药在确保畜禽健康方面取得的成绩得到了广泛认可，寻找新的中药、发挥中医药的优势保障动物的健康更显突出。艾纳香油是贵州地道药材艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.提取艾片的附属产品，具有广泛的生物活性[1-6]，主要含有L-龙脑、樟脑、α-蒎烯、β-蒎烯、芳樟醇、β-石竹烯等[7-9]化合物。目前，有文献报道艾纳香及活性成分具有抗菌作用[10-11]，但用药量均太大(大多数是mg·mL-1)，前期研究发现艾纳香油对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)[12]、副猪嗜血杆菌[2]具有良好的抗菌活性，由于当前市场上没有艾纳香油的质量控制标准，不同来源的艾纳香油由于化学组成差异，其活性有所不同[13]。为此，本文旨在通过体外抗菌试验筛选抗菌活性好的艾纳香油，并筛选其活性成分，为艾纳香油质量标准的制定提供物质基础，并对艾纳香油对S.aureus的抗菌作用进行研究，为其在畜禽养殖业进一步的研究应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

S.aureus(ATCC 13565)、E.coli(ATCC 25922)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonsadaceae，P.arugino.saATCC 27853)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae，GBSATCC 13813)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)均购自中国药品生物制品检定所。SPF级昆明小白鼠，购自于解放军第三军医大学实验动物中心[动物许可证号：SCXK(渝)2012-0003]。艾纳香油A1～A5分别购自于贵州省罗甸县、望谟县5个生产艾纳香油的公司或农户[13]，艾纳香茎叶购自于贵州省罗甸种植户，经贵州大学农学院王华磊教授鉴定为植物艾纳香Blumeabalsamifera(L.)DC.的茎叶，(-)-龙脑、樟脑、(-)-芳樟醇、(+)-芳樟醇、(+/-)-芳樟醇、创愈醇、六氢金合欢烯酰丙酮、反式-石竹烯、氧化石竹烯、(-)-β-蒎烯、(+/-)-α-蒎烯、(-)-α-蒎烯、(+)-α-蒎烯、α-葎草烯、吐温-80分别购自于上海源叶生物科技有限公司、上海同田生物技术股份有限公司。

1.2 主要仪器

HP6890/5975C GC/MS联用仪(Agilent公司)，MultiskanGo型全波段酶标仪(Thermo Fisher scientific公司)，S-3400 N扫描电子显微镜(HITACHI(日立)公司)。

1.3 艾纳香油制备

按中国药典(2015年版)第四部通则挥发油测定仪器装置，参考前期研究[14]采用正交设计提取的9个艾纳香油，分别为B1～B9，正交试验设计优化提取工艺获得的艾纳香油为T。

1.4 不同产源的艾纳香油体外抗菌活性检测

1.4.1 艾纳香油溶液配制 不同产源的艾纳香油(表1)与吐温-80以1∶1比例混悬后，溶于液体培养基，原溶液浓度配制为7、5 mg·mL-1备用。

1.4.2 抑菌圈的测定 参照CLSI2017标准，采用琼脂扩散法，参考文献[15]将细菌菌液调整至108CFU·mL-1、真菌菌液调整至107CFU·mL-1备用，每孔加入100 μL艾纳香油溶液，细菌置37 ℃恒温培养18～24 h，真菌置28 ℃恒温培养48 h，游标卡尺按十字交叉测量抑菌圈直径，每试验重复3次。

1.4.3 MIC、MBC测定 参照CLSI2017标准，采用肉汤微量稀释法、琼脂平板计数法[16]，按倍半稀释法将艾纳香油原溶液进行梯度稀释，96孔板中分别给予艾纳香油溶液各100 μL，加入菌悬液各100 μL。细菌置37 ℃恒温培养18～24 h，真菌28 ℃ 静置恒温培养48 h，孔内溶液澄清无沉淀为药物对该菌的MIC值。吸取澄清孔内的菌液接种于琼脂平板上，观察菌落生长情况，菌落总数<5个为药物对该菌的MBC值。各试验重复3次。

1.5 艾纳香油中抗菌活性成分检测

1.5.1 GC-MS比较分析主要化学成分 参考文献[13]采用GC-MS法对自制的艾纳香油B5、B9及T进行化学成分检测分析，比较其主要化学成分含量。

1.5.2 艾纳香油中部分化合物抗菌活性检测 根据GC-MS分析结果，将(-)-龙脑、樟脑、石竹烯氧化物等化学成分与吐温-80以1∶1比例混悬后，溶于细菌培养基，原溶液浓度配制为7、5 mg·mL-1备用。按“1.4.3”操作方法，测定艾纳香油中部分化合物对S.aureus、P.arugino.sa的MIC、MBC值。

1.6 艾纳香油T对S. aureus感染小鼠的影响

取(28±2)g小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组，空白组、模型组、艾纳香油T高剂量组、艾纳香油T中剂量组、艾纳香油T低剂量组、溶剂组，根据预试验结果，艾纳香油T3个剂量组小鼠分别灌胃20、10、5 mg·mL-1的艾纳香油T溶液0.3 mL·只-1，空白组灌胃等量生理盐水，溶剂组灌胃等量吐温-80，连续灌胃7次，每天1次，第7天灌胃后30 min腹腔注射S.aureus0.2 mL·只-1，攻菌量为5.0×109CFU·mL-1，空白组腹腔注射等量生理盐水，观察小鼠活动，死亡的立即剖解观察各脏器病变。试验观察7 d，观察小鼠死亡情况，7 d后没有死亡的第8天处死小鼠，剖解观察各脏器病变，特别注意观察肾病变[17]情况。

1.7 艾纳香油T对S. aureus 生长的影响

灭菌的肉汤培养基中加入艾纳香油T溶液，使其药物终浓度分别为0.25～4.00 MIC，分别加入菌悬液后于37 ℃、120 r·min-1摇床培养，分别于0、1、3、6、9、12、15、24、48 h取出，测其在OD600 nm时的吸光值，以时间为X轴，OD600 nm值为Y轴绘制S.aureus的生长曲线，每试验重复3次。

1.8 艾纳香油T对S. aureus形态的影响

培养至对数生长期的S.aureus中加入1、2 MBC的艾纳香油T，37 ℃培养12 h，按照扫描电镜常规方法制备样品，于扫描电镜下观察细菌形态变化情况。每组设置3个重复，各试验重复3次。

1.9 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件对试验数据进行分析，组间数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)，动物死亡率及检出率采用Χ2分析，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 不同产源艾纳香油对受试菌株的抗菌效果

2.1.1 抑菌圈测定结果 表1结果显示，不同产源艾纳香油对受试菌株抑菌圈大小均不同，大多数艾纳香油对S.aureus、P.arugino.sa的抑菌圈直径(D)为14～24 mm。根据文献[18]药敏试验判断标准为中介(15～19 mm)或敏感(≥20 mm)，其中，艾纳香油B4、B9、T为敏感，抑菌圈直径均>20 mm。而对E.coli、GBS、Candidaalbicans的抑菌圈直径<4 mm，为耐药。

表1 不同产源艾纳香油对受试菌的抑菌圈直径

2.1.2 MIC、MBC测定结果 根据表2结果可知，不同产源的艾纳香油对S.aureus、P.arugino.sa的MIC值为9.77～78.13 μg·mL-1、MBC值19.54～312.50 μg·mL-1，其中，艾纳香油B9、T对S.aureus的MIC值为9.77 μg·mL-1、MBC值为19.54 μg·mL-1，对P.arugino.sa的MIC值为13.68 μg·mL-1；MBC值为27.35 μg·mL-1，根据文献[19]药敏试验判断标准为中介(8 μg·mL-1

表2 不同产源的艾纳香油对受试菌株的MIC、MBC结果(n=3)

2.2 艾纳香油中活性成分检测

2.2.1 艾纳香油化学成分分析结果 选取艾纳香油B5、B9、T进行GC-MS联用分析，主要化学成分如表3所示，所测试样本中化学成分大致相同，共检测出(-)-龙脑、氧化石竹烯、γ-桉叶油醇、反式-石竹烯、α-桉叶油醇、β-桉叶油醇、樟脑、别香橙烯等36个化合物为共有化学成分，但各油中的主要化学成分百分含量相对占比各不相同。

表3 GC-MS分析B5、B9、T主要化学成分

2.2.2 抗菌化学成分筛选结果 从表4可知，艾纳香油中单体化合物对S.aureus、P.arugino.sa表现出不同的抑菌效果。其中，含量较低的α-葎草烯对S.aureus、P.arugino.sa的MIC值分别为19.54、39.07 μg·mL-1，蒎烯类化合物的MIC值均为78.13～156.25 μg·mL-1。芳樟醇类化合物对S.aureus、P.arugino.sa的MIC值均为156.25～312.50 μg·mL-1，MBC值均为625.00～875.00 μg·mL-1；而含量较高的(-)-龙脑等化学成分的MIC值均>1 000 μg·mL-1

表4 化学成分对受试菌株的MIC、MBC结果(n=3)

2.3 艾纳香油T对S. aureus感染小鼠的保护性试验

与空白组相比，溶剂组、模型组小鼠感染S.aureus后精神萎靡，活动减少、行动缓慢，身体颤抖，试验期间小鼠死亡率均达60%(P<0.05)，无论是试验期间还是第8天处死的小鼠，肾病变检出率、脾体积均明显增加，差异极显著(P<0.01)；艾纳香油T溶液低、中、高剂量组对小鼠感染S.aureus后活动及精神状况均有所改善，小鼠死亡率呈浓度依赖性减少分别为50%、40%、20%，脾肿大和肾病变检出率与模型组相比据其浓度不同也有不同程度减少，差异极显著(P<0.01)。结果详见表5、图1。

表5 艾纳香油T抗S.aureus感染小鼠影响的结果

K.空白组；M.模型组；T-80.溶剂对照组；A.20 mg·mL-1 T组；B.10 mg·mL-1T组；C.5 mg·mL-1T组

2.4 艾纳香油T对S. aureus生长的影响

如图2可知，溶剂组菌株的生长趋势与对照组相同，在6 h后进入对数生长期，具有完整的生长周期。当T溶液浓度为0.25、0.5 MIC作用S.aureus后，菌株在9 h内无明显增殖现象。当T溶液浓度达1MIC时，菌株在24 h内处于抑制状态，无增殖现象，24 h后变化明显；而当T溶液浓度达到2MIC或更高时，S.aureus在48 h内生长曲线几乎维持在水平状态，均无增殖现象。

图2 艾纳香油T对S.aureus生长的影响

2.5 艾纳香油T对S. aureus形态的影响

扫描电镜下观察结果如图3可知，对照组S.aureus呈葡萄串状，菌体和表面完整光滑且外观饱满。与对照组相比，艾纳香油T溶液作用S.aureus后，当浓度为1 MBC时，菌体表现出严重的形态学破坏，菌体分散，表面明显出现褶皱，有不规则凸出及凹陷结构；当浓度为2 MBC时，菌体遭到破坏，表面褶皱、变形严重，出现大规模破碎等现象。

图3 艾纳香油T对S.aureus菌形态的影响

3 讨 论

由于人们越来越重视动物源性食品的安全卫生，许多国家已先后作出了限用和禁用在饲料中添加抗生素的决定，我国农业农村部2019年7月10日发布194号公告中明确指出“退出除中药外所有促生长类药物饲料的添加剂品种”，如何做到不使用抗生素，确保畜禽的健康，使得寻找新的中药、发挥中医药的优势以保障动物的健康更显突出。本文参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)推荐的西药体外药敏试验标准[18-19]，对贵州不同产源的艾纳香油进行抗菌活性的筛选，筛选出艾纳香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa对艾纳香油B9、T敏感或中介。艾纳香油(T)是最佳提取方法获取的艾纳香油，且抗菌效果较强，可作为后续抗菌活性研究开发的试验材料。

艾纳香油对蜡样芽胞杆菌的MIC为0.15 mg·mL-1，对S.aureus和白色念珠菌的MIC为1.2 mg·mL-1[20]；艾纳香油对黄曲霉、黑曲霉等MIC值均为0.625 mg·mL-1，对S.aureus、E.coli、绿脓杆菌的MIC值分别为1.25、2.50、2.50 mg·mL-1[21]；艾纳香中L-龙脑对S.aureus、E.coli、李斯特菌、沙门菌等菌的MIC值均为1.00 mg·mL-1，对红色毛癣菌、假丝酵母菌MIC值均为0.25 mg·mL-1，对黑曲霉MIC值为0.50 mg·mL-1[10]。从这些数据看，艾纳香油用药量均太大(大多数是mg·mL-1)，而本研究的用量是μg·mL-1级，且研究结果是通过反复验证过的，说明艾纳香油抗菌活性是确定的。

目前，中兽药抗菌物质不清楚，抗菌效果不稳定，使用剂量过大，作用机制不明确成为畜牧业上应用的“瓶颈”问题。为寻找艾纳香油中的抗菌活性物质，对艾纳香油B5、B9、T进行GC-MS联用检测分析出共有化学成分36种，且各百分含量均不相同，其中艾纳香油中含量均较高的(-)-龙脑、氧化石竹烯、创愈醇、六氢金合欢烯酰丙酮等化合物无明显抗菌效果。而含量较低的α-葎草烯、蒎烯及芳樟醇类化合物具有一定的抑菌活性，其中，α-葎草烯抑菌效果较好。至于寻找艾纳香油中具有良好抗菌活性的其他化合物或组合，需引入现代更先进的科学方法和技术以获取其抗菌物质。

体内保护试验结果显示，动物模型中肾病理变化与文献报道病变[22-23]一致，艾纳香油对S.aureus感染小鼠有保护作用，且具有浓度依赖性特点，随浓度的升高能预防S.aureus感染小鼠后引起的肾、脾病变的发生。通过不同浓度艾纳香油T溶液作用S.aureus后能不同程度抑制菌株生长，与其他抗菌类药物[24-26]的生长曲线一致。当艾纳香油T溶液浓度≥2 MIC时，菌体形态发生改变，菌体完整性遭到破坏而导致菌株死亡，这将为进一步抗菌作用机制的研究提供试验条件。但具体是通过破坏菌细胞形态、细胞膜破裂导致内容物释放，还是靶向作用菌株后抑制细菌细胞壁合成、抑制核酸的复制与修复、抑制蛋白质合成而破坏细菌的生长而发挥作用，还有待于进一步地深入研究。

4 结 论

艾纳香油对S.aureus和P.arugino.sa具有良好的抗菌活性，筛选出艾纳香油B9、T抗菌效果最好，S.aureus和P.arugino.sa对艾纳香油B9、T敏感或中介。不同产源的艾纳香油抗菌活性略有差异，其化学成分大致相同，但主要化学成分的相对占比各不相同，其中，α-葎草烯、蒎烯和芳樟醇类化合物可能是抑菌关键物质。艾纳香油T对S.aureus感染小鼠有保护作用，呈浓度依赖性抑制S.aureus的生长，可通过坏菌体的完整性，影响细菌生长。