长链非编码RNA MEG3对成骨分化及骨性疾病影响的研究进展

张轩铭，吕松岑

(哈尔滨医科大学附属第二医院关节与运动医学外科，黑龙江 哈尔滨 150086)

非编码RNAs(non-coding RNAs，ncRNAs)是一类没有编码蛋白功能的RNA分子，根据它的大小，可分为小非编码RNA和长链非编码RNAs(long non-coding RNAs，lncRNAs)。lncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA，ncRNA的80%都是长链非编码RNA。人们最初认为lncRNA是转录的垃圾，但后来逐渐发现了lncRNA通过参与调控目的基因的表达，或者通过与启动子和增强子相互作用，进而对染色质重构、DNA甲基化、组蛋白修饰及RNA聚合酶的活性进行调控，从而调节细胞的增殖和分化过程。母系表达的基因3(Maternally expressed gene3，MEG3)是母系表达的lncRNA，为一种位于染色体14q32的肿瘤抑制基因。MEG3通过抑制血管再生进而抑制肿瘤的发展，目前已经了解到MEG3与多种肿瘤相关疾病、癌症(如甲状腺乳头状癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌、结肠癌、视网膜母细胞瘤)、各种炎症反应和心肌梗死等疾病的形成与发展存在着密切的关系。而MEG3在骨性疾病中的功能与作用机制的研究尚处于初步阶段，但现在已经发现MEG3表达的上升或下降可调控干细胞向成骨细胞分化或导致如骨关节炎、骨肉瘤、多发性骨髓瘤等多种骨性疾病的发生，这与MEG3/miR16/SMAD7、MEG3/miR203/Sirt1等多种通路轴有关。故MEG3的表达为后续研究骨性疾病提供了理论基础，对骨性疾病诊断与治疗均有一定的临床意义。

1 MEG3调控干细胞向成骨细胞分化

在胚胎发育过程中，MEG3可能参与包括骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)在内的多种细胞的分化过程。BMSCs是一种具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞分化潜能和自我更新能力的多能的间充质干细胞。BMSCs分离方便、可参与免疫调节、修复骨组织微环境、作为成骨细胞的主要来源，因此成为目前骨组织工程研究领域的理想细胞，为骨组织重建提供了更佳的治疗方案[1]。

那么，MEG3是如何调控BMSCs向成骨细胞等细胞分化的呢？Zhuang等[2]研究表明，MEG3通过阻止骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，BMP4)启动子区域中性别决定区域的抑制作用，促进位于其下游数个Mbs处BMP4的转录翻译过程，进而促进多发性骨髓瘤患者的人BMSCs向成骨细胞分化。Sun等[3]研究显示，在糖尿病相关性勃起功能障碍的大鼠模型海绵体内植入BMSCs，可以有效改善大鼠的勃起功能，同时海绵体组织中MEG3的表达显著降低。而在体外，通过外源性血管内皮生长因子诱导BMSCs向内皮细胞的分化过程中，MEG3的表达也显著下调。进一步证实了MEG3的下调有利于BMSCs向内皮细胞分化。MEG3通过促进叉头盆蛋白质M1(forkhead box protein M1，FOXM1)泛素化使FOXM1蛋白降解，从而降低血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，最终调节BMSCs向内皮细胞ECs分化。Li等[4]对48例骨折患者及30名健康体检者的血清样本进行检测发现，骨折患者血清中的lncRNAMEG3的表达明显升高，MEG3通过激活Wnt/β-catenin信号通路进而激活成骨细胞MC3T3-E1细胞的增殖与分化，因此，对MEG3的研究有望成为促进骨折愈合的新靶点。以上研究表明，MEG3可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路和促进FOXM1的泛素化与BMP4蛋白的转录翻译过程，进而促进BMSCs与成骨细胞的分化。

Li等[5]实验检测到MEG3的表达在人脂肪来源干细胞分化成脂肪细胞的成脂过程中下调，在其分化为成骨细胞的成骨过程中上调。而敲减MEG3可促进人脂肪来源干细胞的成脂分化，抑制其成骨分化。相反地，miR-140-5p在成脂过程中上调，在成骨过程中下调，与MEG3呈负相关。因此，MEG3参与了人脂肪来源干细胞的成脂过程和成骨分化的过程，其机制可能与MEG3参与调节miR-140-5p的表达过程有关。Wang等[6]从去卵巢的小鼠病理模型和绝经后骨质疏松症患者中分离培养BMSCs。实验发现去卵巢小鼠和PMOP患者BMSCs中的MEG3和miR-133a-3p的表达都增加了，BMSCs中MEG3和miR-133a-3p的表达正相关。在BMSCs到成骨细胞的分化过程中，MEG3和miR-133a-3p的表达显著降低，并且MEG3的过表达可逆转成骨分化过程所介导的miR-133a-3p的下调。从而得出结论，MEG3可通过上调miR-133a-3p抑制去卵巢小鼠和绝经后骨质疏松症患者BMSCs的成骨分化过程。Liu等[7]发现与健康牙周膜组织相比，牙周炎牙周膜组织的MEG3与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)表达下调，miR-27a-3p表达上调，存在着MEG3/IGF1/miR-27a-3p调控轴，过表达MEG3可通过增强IGF1的表达而抑制miR-27a-3p的表达，进而促进牙周膜干细胞的成骨分化，而上调miR-27a-3p的表达可抑制成骨分化。以上研究结果表明，存在MEG3-miRNA的调控网络，MEG3是miRNA-140-5p、miR-133a-3p与miR-27a-3p的上游靶基因，MEG3可通过调控miRNA的表达，进而调控成骨细胞的分化过程。

2 MEG3与骨相关疾病

2.1 MEG3与骨关节炎(osteoarthritis，OA)关系 骨关节炎是一种常见的慢性关节疾病，在病理上可观察到局部炎症和滑膜炎等表现，早期患者可通过口服非甾体抗炎药镇痛或关节腔内注射玻璃酸钠缓解症状，晚期老年患者可通过关节置换手术治疗。但是，通过口服非甾体抗炎药或关节腔内注射玻璃酸钠缓解症状并不能从根本上修复已经被破坏的软骨，而关节置换这类手术级别较大，对患者的身体心理都存在的考验[8]。截至目前，骨关节炎的发病机制、原因和有效的治疗方案仍不清晰。研究表明如H19、MSI2-AS1、MEG3等多种lncRNA与OA的发展都具有十分紧密的联系[9-10]。

Xu等[11]研究发现，存在MEG3/miR16/SMAD7通路，敲减大鼠软骨细胞中的MEG3可以上调miR16促进软骨细胞增殖，抑制由外源性白细胞介素(interleukin，IL)-1β诱导的炎性软骨细胞模型中SMAD7的表达，导致骨关节炎。同时，miR16上调可抑制IL-1β诱导的软骨细胞中SMAD7的表达从而促进促炎细胞因子生成，达到促进炎症反应的目的。SMAD7是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路的细胞内拮抗剂，在许多炎症相关疾病中发挥作用，例如SMAD7的上调可以抑制慢性肾脏病中的NF-kB信号而达到抗炎的作用，这可能与其抑制骨关节炎的机制相关。相反地，MEG3上调可通过抑制miR16的表达，从而上调外源性IL-1β诱导的炎性软骨细胞中SMAD7的表达，缓解骨关节炎。以上结果表明，存在MEG3-miRNA-mRNA的调控网络，MEG3是miRNA的上游靶基因，通过调控miRNA的表达，进而调控下游mRNA的翻译过程，从而在OA中发挥着作用。

Li等[12]研究表明，在亚甲基蓝诱导的OA兔子模型中，MEG3的mRNA水平显著增加，与对照组相比，P2X嘌呤受体3(P2X Purinergic receptors 3，P2X3)的蛋白质表达、IL-6、IL-8、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达均受到显著抑制。亚甲基蓝可通过上调lncRNAMEG3的水平，抑制了P2X3表达从而缓解了OA相关疼痛和OA动物模型中的炎症反应。MEG3可以通过抑制血管生成而起到肿瘤抑制剂的作用。而骨关节炎又与血管生成密切相关，故抑制血管生成提供了一种减轻骨关节炎的炎症与疼痛的新型办法。

Su等[13]通过逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测20名OA患者和10名健康志愿者的关节软骨样本中MEG3和血管内皮生长因子的mRNA和蛋白质表达，结果显示，与正常软骨样品相比，OA患者中MEG3显著下调，VEGF的mRNA水平和蛋白质水平却显著上调。表明MEG3水平与VEGF水平负相关，MEG3可通过调节血管生成参与OA发展。以上研究结果表明，MEG3可能是通过抑制P2X3、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α以及VEGF等与血管生成相关的因子，从而对OA产生影响。

Wang等[14]实验表明，脂多糖可降低细胞活性，增强细胞凋亡的过程，促进促炎因子的释放，下调MEG3的表达。作为miR-203的竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)，MEG3的敲减可通过调节miR-203正向调控Sirt1的表达过程，进而激活PI3K/AKT和NF-kB通路，从而缓解脂多糖诱导的ATDC5细胞中的炎性伤口，即存在着MEG3/miR203/Sirt1的这样一个调控通路轴；同时Sirikaew等[15]研究发现，脂多糖还可以破坏亚洲大象的软骨细胞，导致大象骨关节炎的形成。这数项研究为骨关节炎或多种炎性伤口的治疗提供了一个潜在的方案。以上研究表明，MEG3可作为ceRNA，可通过吸附miRNAs，进而与miRNAs相互竞争来调控编码蛋白，激活PI3K/AKT和NF-kB等信号通路，从而调控骨关节炎的发展(见图1)。

2.2 MEG3与骨肉瘤(osteosarcoma，OS)的关系 骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，在青少年和儿童中普遍存在。一般人群中，20岁以下的美国人骨肉瘤的发病率约为0.005‰，5年存活率约为70%，有20%～30%复发或转移的可能。虽然近年来骨肉瘤的诊断和治疗有所发展，分子靶向治疗、手术治疗等是针对骨肉瘤最重要的治疗方案，但是相同治疗方法下每个个体反应有差异，这是预后改善的一大障碍[16]。

图1 MEG3对骨关节炎OA影响通路示意图

因此，我们需要探索骨肉瘤发展机制并确定其潜在的治疗靶点以针对骨肉瘤更有效的治疗。

Shen等[17]研究发现存在MEG3/miR-361-5p/FOXM1信号传导通路。MEG3和miR-361-5p在人骨肉瘤组织和细胞系中均显著下调，而FOXM1在骨肉瘤组织和细胞系中上调。上调MEG3和miR-361-5p或下调FOXM1会抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。Li等[18]研究发现，在人骨肉瘤组织中，9种lncRNA(91H、BCAR4、FGFR3-AS1、HIF2PUT、HOTTIP、HULC、MALAT-1、TUG1、UCA1)的表达上调，并被认为是骨肉瘤的致癌基因；两种lncRNA(Loc285194和MEG3)的表达下调，并被认为是骨肉瘤的肿瘤抑制剂。骨肉瘤组织中MEG3的表达明显低于邻近的非肿瘤组织，并且与临床分期和远处转移相关。相比于正常组织和细胞系，骨肉瘤中miR-664a表达水平相对较高；然而，miR-664a和lncRNA MEG3在骨肉瘤进展中的相互作用尚未见报道。因此，Sahin等[19]将miR-664a抑制剂转染于人成骨细胞系hFOB 1.19与人骨上皮骨肉瘤细胞系U2 OS中，发现MEG3基因的表达水平增加，miR-664a的表达水平降低。此外，MEG3和miR-644a表达水平的变化可干扰骨肉瘤细胞的迁移速度，miR-664a表达上调对MEG3的基因表达和骨肉瘤细胞的迁移具有抑制作用。以上研究表明，MEG3可能作为miRNA的上游靶基因，通过MEG3-miRNA-mRNA的网络对miRNA的水平产生影响，进而调节影响骨肉瘤细胞增殖、迁移与侵袭的基因水平，从而抑制骨肉瘤的增殖。

ceRNA的网络已经被证实存在于舌鳞状细胞癌、喉癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤相关疾病中[20-21]。Jiang等[22]研究表明MEG3可作为ceRNA竞争性结合miR-424与miR-182通过这种ceRNA网络在骨肉瘤疾病中发挥作用。

Tian等[23]发现，MEG3的上调是骨肉瘤以及其他类型癌症(如前列腺癌)预后较好的指标。Shi等[24]实验发现，MEG3在培养的人骨肉瘤细胞系MG63中表达较低，MEG3可促进MG63细胞的凋亡，抑制MG63细胞的增殖与侵袭。随着MEG3的上调，MG63细胞中的抑癌基因p53的转录活性升高，癌基因MDM2的表达降低。以上研究表明，MEG3可以通过影响原癌基因与抑癌基因的活性，进而减缓或抑制骨肉瘤的癌变过程。

Liu等[25]研究已经证明，MEG3可通过Notch等信号通路促进缺血性脑损伤患者的脑血管生成。为了进一步探讨MEG3对骨肉瘤细胞的影响机制，Zhang等[26]研究发现，与正常人成骨细胞系hFOB1.19相比，人骨肉瘤(human osteosarcoma，HOS)细胞系MG63和U2OS中MEG3的表达显著下调。而MEG3的过表达会明显抑制MG63细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤相关因子TGF-β、N-cadheren、Notch1和Hes1的mRNA和蛋白质的表达，上调E-cadheren的表达水平。结果表明MEG3可通过抑制Notch和TGF-β信号通路阻止OS细胞生长和转移，这为OS治疗提供潜在的治疗靶点。

2.3 MEG3与多发性骨肿瘤(multiple myeloma，MM)的关系 截至目前，MM是一种无法治愈的疾病，其特征是骨髓中恶性浆细胞的异常增殖和异常积聚。作为一种常见的血液系统恶性肿瘤，发病率仅次于非霍奇金淋巴瘤，是美国第二常见血液病。尽管MM可通过蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体、嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)等新型治疗方法，但患者的存活率仍然非常低。主要是由于治疗后耐药率和疾病复发率高[27]。MM的骨髓瘤细胞分泌破骨细胞活性因子、激活破骨细胞从而引发病理性骨折，临床表现为骨质疼痛、贫血、骨骼变形[28]。

Shen等[29]研究发现，MEG3在人MM患者中下调，miR-181a在MM患者中过表达，与其促癌功能一致。此外，MEG3作为miR-181a的ceRNA，MEG3可在体外“海绵性”结合miR-181a，影响miR-181a对其靶基因HOXA11的调节功能，抑制MM进展。故存在MEG3/miR-181a/HOXA11调控网络，对MEG3进行调控是治疗MM患者的有前景的治疗方案。甲基化是目前研究最多的表观遗传修饰，可参与细胞分化和细胞周期调节等各种生物过程[30]。Benetatos等[31]使用甲基化特异性聚合酶链反应评估21名MM患者发现，多发性骨髓瘤患者MEG3基因的甲基化区域的启动子高甲基化。以上研究表明，MEG3可以作为ceRNA，通过吸附miRNA进而与miRNA相互竞争，从而对靶基因做出调控，进而抑制多发性骨髓瘤的进展。

3 小 结

由此可见，MEG3可以调控干细胞向成骨细胞分化的过程，并且与骨关节炎、骨肉瘤、多发性骨髓瘤等骨性疾病联系十分密切。主要包括以下四种主要的机制：(1)存在MEG3-miRNA-mRNA的调控网络，MEG3可以作为miRNA的上游靶基因，通过调控mRNA的翻译过程进而对成骨分化以及骨性疾病产生影响。(2)存在ceRNA网络，MEG3可以作为ceRNA吸附miRNA，进而与miRNA相互竞争调控编码基因的蛋白表达过程从而对成骨分化及骨性疾病产生影响。(3)MEG3可以通过激活Wnt/β-catenin、Notch、PI3K/AKT和NF-kB和TGF-β等信号通路与FOXM1的泛素化等过程对成骨分化以及骨性疾病产生影响。(4)MEG3能够直接调控和成骨分化与骨性疾病相关的编码基因，如原癌基因与抑癌基因等影响成骨分化与骨性疾病。因此，针对MEG3表达的研究可以为骨折患者及其他骨性疾病患者的治疗提供潜在的靶点。MEG3能够作用于多种miRNA或其他靶基因，从而形成一个十分复杂的骨代谢相关的调控网络，但是MEG3对骨性疾病的发生、发展、预后影响的调节作用以及调控机制尚不清晰，这也是目前国内外对MEG3研究的最大难题，有待于我们后期更深入的研究。相信随着技术的突破，我们会逐渐了解MEG3如何调节骨代谢平衡及MEG3对骨相关疾病的调控机制这一研究热点，从而为临床上治疗骨性疾病提供更加可靠的理论依据。