口腔白斑病癌变相关缺氧应答基因和微小RNA的芯片检测及表达验证

施琳俊 杨溪 吴苏宁 刘伟

1.上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔黏膜病科，国家口腔疾病临床研究中心，上海市口腔医学重点实验室/上海市口腔医学研究所，上海200011；2.上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面头颈肿瘤科，上海200011；3.江南大学附属医院（第三人民医院）口腔科，无锡214000

口腔白斑（oral leukoplakia）是一种常见的口腔黏膜潜在恶性疾病，是口腔鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）的重要来源[1]。白斑的癌变率为4%～18%[1-4]。上皮异常增生是白斑重要的病理特征，从无异常增生、轻-中-重度异常增生到癌变进程各阶段较明确，白斑发生发展到癌变是肿瘤发生的良好研究模型。细胞低氧感知与响应的研究提示细胞缺氧微环境是恶性肿瘤发生的重要条件[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度在22 个核苷酸左右的非编码单链RNA，参与转录后基因调控。研究[6-7]显示，miRNA 对缺氧应答基因起着重要调控作用，并参与肿瘤发生。本研究利用人转录组芯片研究口腔白斑患者病损发生发展中的缺氧应答基因及相关miRNA，并验证癌变进程中的关键基因及其相关miRNA的表达。

1 材料和方法

1.1 材料

纳入转录组芯片研究的组织包括3例正常口腔黏膜、8 例口腔白斑、6 例口腔早期鳞癌（T1-2N0M0）。收集于2014 年9—12 月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜科和颌面头颈肿瘤科。8 例口腔白斑中，4 例无/轻度上皮异常增生，4 例中-重度上皮异常增生，本研究将其分别归为低危白斑和高危白斑。纳入差异基因验证表达研究的组织包括6 例正常黏膜、12 例口腔白斑、12 例口腔早期鳞癌，收集于2018 年6—12 月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔黏膜科和颌面头颈肿瘤科。以上组织病理学诊断是依据世界卫生组织肿瘤分类标准[8]，由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科医师确认。组织样本为活检或手术后标本，放入装有RNAlater 液的冻存管，立即置入液氮保存15 min 以上，然后转入-80 ℃冰箱保存。所有患者术前均未进行化疗、放疗及激素等治疗，且无自身系统性疾病和癌症史。正常黏膜、口腔白斑和早期鳞癌3组患者的年龄和性别等因素均无统计学差异。研究对象均签署知情同意书，本研究获得上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准（2016-80-T37）。

1.2 总RNA提取和质检

按照TRIzol 试剂盒常规提取组织中总RNA，利用NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific公司，美国）测定浓度及OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。纳入本研究的组织样本RNA 的OD260/OD280比率均在1.8 和2.1 之间，OD260/OD230值均大于1.8，检测显示RNA 质量良好，符合实验要求。

1.3 转录组芯片研究

样本的标记、转录组学芯片的杂交以及洗脱检测按照Affymetrix GeneChip 人转录组芯片（human transcriptome array，HTA）2.0 标准流程执行。首先，总RNA 反转录成双链cDNA，再进一步合成cRNA，接着对cRNA进行第2轮反转录合成cDNA，片段化并与生物素标记后与芯片杂交，洗脱和染色后扫描得到原始图像。采用Affymetrix Gene-Chip Command Console 软件处理提取原始数据和Expression Console 软件对芯片进行基因水平的标准化。利用Genespring 软件分析差异基因，根据t检验的P值和倍数变化值进行筛选，筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≥2.0 且P值＜0.05。接着，对差异基因进行基因本体论（gene ontology，GO）功能分析，按照GO 生物学作用分类，筛选出生物学作用为缺氧应答的基因。最后，对差异基因进行非监督层次聚类，展示差异基因在不同样本间的表达模式。

1.4 实时定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）

利用HiScript ⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）将待测RNA 逆转录成cDNA。Roche LCPDS2软件设计引物，缺氧关键基因低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）、趋化因子配体2（chemokine cc-motif ligand 2，CCL2）、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP3）和miRNA的引物序列见表1。利用QuantiFast®SYBR®Green 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒（Qiagen 公司，德国）在LightCycler®480 Ⅱ型荧光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）上进行反应。体系：2×QuantiFast®SYBR®Green PCR Master Mix，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40个循环。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60 ℃缓慢升温至97 ℃，每℃采集5 次荧光信号。GAPDH 和ACTB 分别作为mRNA 和mi-RNA 的内参，采用2-ΔΔCt法测定相对表达水平，设置3个重复孔，计算其均数和标准差。

表1 缺氧关键基因和miRNA的引物序列Tab 1 Primer sequences of hypoxia key gene and miRNA

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0 统计软件进行分析。采用方差分析比较各组间基因定量表达的差异，以P＜0.05为有统计学差异。利用STRING-蛋白质相互作用线上数据库对白斑癌变缺氧应答蛋白的相互作用构建网络关系图，利用miRWalk 综合型的miRNA靶基因数据库预测hsa-miR-21-5p 的靶基因与白斑发生发展缺氧应答相关基因取交集。

2 结果

2.1 口腔白斑病各阶段的差异表达基因

转录组芯片检测结果显示：正常黏膜与低危白斑间有855个差异基因，低危白斑与高危白斑间有399 个差异基因，高危白斑与早期鳞癌间有797个差异基因（图1）。

图1 口腔正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鳞癌组间的差异基因数目Fig 1 The number of differential genes in normal mucosa，lowrisk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.2 口腔白斑病各阶段的缺氧应答差异表达基因

GO 功能分析结果表明，正常黏膜与低危白斑间有7个缺氧应答差异基因，低危白斑与高危白斑间有10 个缺氧应答差异基因，高危白斑与早期鳞癌间有21 个缺氧应答差异基因（图2），具体基因名称和位点见表2。

图2 正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鳞癌的组间差异缺氧应答基因数目Fig 2 The number of differential hypoxia genes in normal mucosa，low-risk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.3 口腔白斑病各阶段的差异miRNA

转录组芯片检测结果显示：正常黏膜与低危白斑间有56 个差异miRNA，差异最大的前3 位是miR-12 （下调18.75 倍）、miR-124 （上调10.19倍）、miR-367（下调4.30 倍）；低危白斑与高危白斑间有25 个差异miRNA，差异最大的前3 位是miR-118（上调3.84 倍）、miR-934（下调2.82 倍）、miR-98（下调2.67 倍）；高危白斑与早期鳞癌间有68 个差异miRNA，差异最大的前3 位是miR-675（下调8.67 倍）、miR-650（上调4.11 倍）、miR-21（上调3.71倍）（图3）。

表2 口腔白斑病各阶段的缺氧应答差异表达基因Tab 2 Differential hypoxia gene expression in each stage of oral leukoplakia

图3 正常黏膜、低危白斑、高危白斑和早期鳞癌的组间差异miRNA数目Fig 3 The number of differential miRNA in normal mucosa，lowrisk oral leukoplakia，high-risk oral leukoplakia and SCC

2.4 白斑癌变缺氧应答基因和miR-21的网络关系

高危白斑到早期鳞癌这一关键阶段的21 个差异缺氧应答基因和miR-21 的网络关系分析结果显示：HIF1α、CCL2 和MMP3 位于蛋白质相互作用网络图的关联中心，可视作关键基因。miRWalk数据库预测靶基因显示：miR-21 的靶基因与其中10个缺氧应答差异基因相关联。

2.5 白斑缺氧应答基因和miRNA的验证

qRT-PCR 结 果表明：HIF1α、CCL2、MMP3的mRNA 和miR-21 在正常黏膜、口腔白斑和早期鳞癌中的相对表达量均呈阶梯式升高，在白斑与早期鳞癌之间的表达差异均具有统计学意义（图4），这与转录组芯片结果基本一致。

3 讨论

口腔黏膜白斑癌变是由多基因异常参与的组织细胞结构和功能改变的多步骤过程，高危白斑的早期诊断及危险评估尤为重要。目前，临床上常用视诊、触诊、常规病理学进行口腔癌前病变的诊断和评估，而细胞基因改变发生于组织形态学改变之前，研究白斑发生发展进程中基因组学改变对癌变早期诊断及分子机制研究具有重要作用。单个或数个分子蛋白不足以阐明白斑与鳞癌之间的差异[9-10]，高通量的组学研究可能更具有优势。本研究选取的Affymetrix GeneChip HTA 2.0 芯片是新一代全转录组芯片，该芯片设计了近700万条探针，可以检测超过28 万条全长转录本，包括超过24 万条编码转录本RNA 和超过4 万条非编码转录本RNA。

图4 缺氧应答基因HIF1α、CCL2、MMP3 mRNA和miR-21在正常黏膜、白斑和早期鳞癌中的表达Fig 4 Expression of HIF1α, CCL2, MMP3 mRNA and miR-21 in normal mucosa, oral leukoplakia and SCC

纳入转录组芯片的梯度式病例设置是本研究的特色。针对口腔白斑的发生发展，本研究设置4种病例，正常黏膜（n=3）、低危白斑（n=4）、高危白斑（n=4）、早期鳞癌（n=6），模拟白斑癌变的多步骤进程，研究结果可反映白斑癌变不同阶段的分子生物学特性。回顾文献，学者们对此也进行过相应研究，如对正常黏膜（n=3）和白斑（n=3）进行Affymetrix U133 plus 2.0 基因芯片研究[11]，对正常黏膜（n=10）和白斑（n=10）进行Agilent 基因组学芯片研究[12]，对白斑（n=3）和鳞癌（n=3）进行SupperArray基因芯片研究[13]。而本研究的芯片病例设置为白斑发生发展的各阶段，这是区别于既往的对白斑的芯片研究的特色之处。由于研究的病例数较少，故又通过qRT-PCR 实验验证基因表达。

细胞低氧微环境与肿瘤发生有着紧密的联系。研究[5]表明，肿瘤超过1～2 mm3须依赖血管生成和氧气，肿瘤内部由于癌细胞不受控的快速分裂增殖，导致大量细胞聚集在一起，却没有血管可以带来养分和氧气，肿瘤内部的细胞通常会陷入低氧环境中，从而通过HIF-1α 开启或增强一系列基因的表达，其中包括促进能量物质无氧酵解的酶，导致癌细胞规避失巢凋亡并启动迁移机制的信号通路。段宁等[14]对白斑（n=4）和鳞癌（n=4）进行单核苷酸多态性芯片研究，发现异常基因主要位于第3、5～9、11、13～15、17、18染色体。本项目筛选出的缺氧相关基因位点亦多位于这些染色体。

本研究中转录组芯片筛选出白斑发生发展各阶段的缺氧应答基因，重点关注从高危白斑到早期鳞癌这一阶段的关键基因。研究表明，HIF1α、CCL2 和MMP3 位于蛋白质相互作用网络图的关联中心，可视作关键基因。挑选miR-21 作为关键miRNA，其主要原因是miR-21 与缺氧应答关系密切，是调控缺氧应答反应的关键miRNA[15]。qRTPCR实验结果表明，HIF1α、CCL2和MMP3 mRNA和miR-21在白斑发展到早期鳞癌过程中显著上调。从HIF-1α 和miR-21 在癌症中的功能研究看：缺氧下的间充质干细胞分泌的胞外囊泡显著增强肺癌细胞的增殖、存活率、侵袭性、上皮间质转化以及巨噬细胞M2 偏振，沉默miR-21 可显著消除缺氧下的胞外囊泡对癌症和巨噬细胞M2极化，表明缺氧微环境下通过细胞外囊泡中的miR-21 上调可显著减少肺癌细胞凋亡和促进巨噬细胞M2极化来促进肺癌的发展；miR-21 在放疗抵抗的肺癌细胞中上调HIF1α，并促进糖酵解关键酶表达，通过HIF1α基因沉默可抑制糖酵解并使肺癌细胞对放疗重新敏感，而在miR-21 抑制的放疗抵抗细胞中HIF1α过表达可导致肺癌细胞重获放疗抵抗，表明miR-21 通过上调HIF1α 和促进糖酵解增加放疗抵抗作用；此外，缺氧微环境可上调人乳腺癌细胞MCF-7 中的HIF-1α 和miR-21 表达，其机制可能是上调的miR-21 通过多个信号通路调控靶基因进而影响癌细胞的增殖及凋亡。

目前，缺氧应答基因与口腔潜在恶性疾病的相关研究较少，本研究的结果提示HIF-1α 等基因和miR-21 导致的缺氧响应在癌变进程中具有重要性，白斑癌变微环境中miR-21 与HIF-1α 的信号通路和分子机制值得进一步研究。本文为白斑发病和癌变的分子机制、寻找白斑早期诊断的分子标记的深入研究提供新依据，为白斑的发生发展机制和标志性癌变基因探针的筛查奠定了基础。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。