miR-590在IgA肾病患者尿液及血清中的表达及临床意义

杨永红 张鑫 李莹 苏丽

(解放军总医院第七医学中心肾脏病科，北京 100700)

IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)是一种临床较为常见的原发性肾小球疾病，以肾功能下降、蛋白尿为主要临床表现，其进展缓慢，预后较差，对患者生存质量构成极大威胁[1]。目前，IgAN发病机制尚未完全阐明，但研究认为其发病与免疫调节、遗传、炎症反应、血管生成、微小RNA(microRNA，miRNA)等有关[2-3]。相关报道显示，miRNA可在相关基因转录、表达中起重要调控作用，其作为诊治IgAN的指标[4]。有关研究显示，miR-590-3p作为微小RNA-590(miRNA-590，miR-590)成员之一，其在IgAN患者血清中表达上调，miR-590-3p可能参与并影响IgAN发病过程[5]。但miR-590在IgAN患者尿液中的表达情况，及其在患者尿液、血清中的水平与调节血管生成的因子的关系尚未见报道。基于此，本研究通过检测miR-590在IgAN患者尿液、血清中的表达水平，分析其与疾病严重程度及调节血管生成因子的关系，以期为早期诊治IgAN、评估患者病情提供一定依据。

1 临床资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年1月～2020年2月本院收治的85例IgAN患者作为IgAN组，按照IgAN患者24h尿蛋白量将患者分为轻度组(尿蛋白量<1.0g，33例)、中度组(尿蛋白量1.0～3.0g，38例)、重度组(尿蛋白量>3.0g，14例)。另选取同时间段内87例体检健康者作为对照组。IgAN诊断标准：参考《IgA肾病临床诊治指南(解读)》关于IgAN相关判定标准进行诊断[6]。纳入标准：①患者均符合IgAN诊断标准，经肾穿刺活检术确诊。②患者临床资料均完整。③患者均知情同意。排除标准：①肝病、过敏性紫癜、系统性红斑狼疮所引发的继发性IgAN。②肾脏移植者。③合并肿瘤、心脑血管疾病者。所有受试者本人或其家属签署知情同意书，本项研究方法符合《赫尔辛基宣言》，且经本院伦理委员会审核、批准后实施(伦理批号：10201601103)。

1.2 主要试剂与仪器 尿液miRNA纯化试剂盒(货号：NGB-29000)购自艾美捷科技有限公司，血清miRNA纯化试剂盒(货号：ALH601)购自北京百奥莱博科技有限公司，miScript Reverse Transcription Kit试剂盒(货号：218061)购自上海北诺生物科技有限公司，TaqMan© Fast Advanced Master Mix试剂盒(货号：4352042)购自北京祥生兴业科技有限公司；人血管抑素酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)(货号：3010034)购自北京索莱宝科技有限公司。紫外分光光度计(型号：ND 1000)购自上海在途生物科技有限公司，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)仪(型号：LightCycler© 480II)购自罗氏诊断产品(上海)有限公司，酶标仪(货号：HBS-1096A)购买于上海研卉生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本收集 收集患者入院次日、健康者体检当日清晨空腹肘关节静脉血、尿液标本。各收集3～4mL静脉血、尿液于离心管中，均在4℃环境下，以4300r/min离心8min，吸取上清液置于冻存管中，于-80℃冰箱中保存，待检。

1.3.2 qRT-PCR检测尿液和血清中miR-590表达水平 从-80℃环境中取出适量冻存尿液、血清样本，冰上解冻，加适量cel-miR-39用于校正尿/血清miR-590水平，根据相应miRNA纯化试剂盒说明书纯化miRNA。依照反转录miScript Reverse Transcription Kit试剂盒说明书配制反应体系，将RNA反转录成cDNA。最后，参考PCR试剂盒TaqMan© Fast Advanced Master Mix说明书，配反应体系，进行qPCR检测。以2-ΔΔCT法分析尿液、血清miR-590相对表达量，ΔC=目的基因CT值-cel-miR-39 CT值。

1.3.3 ELISA法检测尿液和血清中血管抑素水平 将人血管抑素ELISA试剂盒所携带的标准品配制成不同浓度的标准样品，利用酶标仪检测不同浓度标准品在450nm处的吸光度值，绘制标准品回归曲线，测定待测尿液及血清样本在450nm处的吸光度值，根据标准曲线计算尿液及血清血管抑素浓度。

2 结果

2.1 两组一般资料对比 IgAN组中男性50例，女性35例，年龄34～64岁，平均(47.74±9.76)岁；对照组中男性48例，女性39例；年龄35～63岁，平均(47.06±9.35)岁。IgAN组、对照组性别构成、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.2 两组尿液、血清miR-590、血管抑素水平比较 与对照组相比，IgAN组患者尿液、血清中miR-590、血管抑素水平均显著升高(P<0.05)，见表1。

表1 两组尿液、血清miR-590、血管抑素水平比较

2.3 不同程度IgAN患者尿液、血清miR-590、血管抑素水平比较 与轻度组相比，中度组、重度组IgAN患者尿液miR-590、血管抑素水平均显著升高(P<0.05)，且两者水平随病情加重升高越显著；与轻度组相比，中度组、重度组IgAN患者血清miR-590、血管抑素水平均显著升高(P<0.05)，且两者水平随病情加重升高越显著，见表2。

表2 不同程度IgAN患者尿液、血清miR-590、血管抑素水平比较

2.4 IgAN患者尿液、血清miR-590表达水平与血管抑素的关系 Pearson相关性分析结果显示，IgAN患者尿液、血清miR-590表达水平与血管抑素水平均呈正相关(r=0.479、0.472，均P<0.05)，见图1、2。

图1 IgAN患者尿液中miR-590表达水平与血管抑素的关系

2.5 尿液、血清miR-590、血管抑素水平对 IgAN的诊断价值 ROC曲线显示，尿液中miR-590对IgAN诊断的曲线下面积(Area Under Curve，AUC)为0.837(95%CI:0.777～0.896)，截断值为1.36，其灵敏度、特异度分别为76.5%、80.5%；血管抑素对IgAN诊断的AUC为0.849(95%CI:0.788～0.910)，截断值为59.25ng/L，其灵敏度、特异度分别为78.8%、88.5%；两者联合对IgAN诊断的AUC为0.903(95%CI:0.859～0.947)，其灵敏度、特异度分别为82.4%、86.2%，见图3。血清中miR-590对IgAN诊断的曲线下面积AUC为0.822(95%CI:0.760～0.884)，截断值为1.38，其灵敏度、特异度分别为72.9%、80.5%；血管抑素对IgAN诊断的AUC为0.833(95%CI:0.770～0.896)，截断值为60.58ng/L，其灵敏度、特异度分别为71.8%、87.4%；两者联合对IgAN诊断的AUC为0.910(95%CI:0.869～0.952)，其灵敏度、特异度分别为91.8%、80.5%，见图4。

图2 IgAN患者血清中miR-590表达水平与血管抑素的关系

图3 尿液中miR-590、血管抑素对IgAN的诊断价值

图4 血清中miR-590、血管抑素对IgAN的诊断价值

3 讨论

IgAN是免疫球蛋白以弥漫颗粒/团状沉积在毛细血管、肾小球系膜所引起的肾脏病理改变疾病，以肾小球硬化、肾间质纤维化、细胞外基质大量堆积、慢性炎症、巨噬细胞、淋巴细胞浸润为主要病理表现，常表现为急性肾炎、血尿、肾功能衰竭，严重危及患者健康[7]。此外，活检穿刺法是临床判定IgAN的最重要手段，但其操作复杂，具有创伤性，因此，需要寻找操作简便、有效诊断IgAN、判断病情的指标。

miRNA广泛存在于组织、血液、尿液中，在信号转导、细胞增殖、凋亡、迁移、炎症反应、免疫调节、血管形成等生物学过程中发挥重要调节作用，与肾癌、狼疮性肾炎、IgAN等关系密切[8-12]。研究发现，miR-590-5p可靶向结合相应受体，调节caspase3信号通路，进而影响肾癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭，其有望成为治疗肾癌的靶标[13]。体外研究证实，miR-590-3p通过靶向结合肿瘤坏死因子受体相关因子6，进而影响脂多糖诱导的急性肾损伤及足细胞凋亡情况[14]。此外，Zhai等[4]发现miR-590-3p可能通过靶向高迁移率族蛋白B2，调节半乳糖缺陷型IgA1表达，进而影响IgAN疾病进展，miR-590-3p有助于判定疾病严重程度。本研究中IgAN组患者尿液、血清中miR-590水平明显高于对照组，且miR-590表达水平随IgAN疾病严重程度加重呈升高趋势，提示尿液、血清miR-590可能与IgAN发展进程有关，其有利于评估患者病情。推测，miR-590作为miRNA家族成员，其可能通过与有关靶基因结合，调节免疫炎症反应，影响细胞增殖、凋亡过程，从而在IgAN发展中起调控作用，但具体作用机制有待进一步研究证实。

血管抑素是纤溶酶原蛋白水解产物，其可通过抑制内皮细胞增殖、迁移，促进内皮细胞凋亡，进而在血管形成过程中发挥抑制作用[15]。研究显示，血管抑制素在狼疮性肾炎患者尿液中水平升高，可作为诊断狼疮性肾炎的非侵入性指标[16]。另有研究发现，血管抑素水平升高会减少肾小管周围毛细血管(peritubular capillary，PTC)数量，减缓血流速度，引发肾功能不全[17]。以上研究证实，血管抑素可能在肾脏疾病中起重要作用。此外，Xia等[18]发现血管抑素在IgAN患者尿液中水平显著升高，其可能成为评估IgAN严重程度的靶标。本研究中IgAN组患者尿液、血清中血管抑素水平均显著高于对照组，且其水平随IgAN疾病加重而明显增加，提示尿液、血清中血管抑素可能与IgAN病变进展相关，其有助于判断患者疾病进展程度。究其原因，高水平血管抑素可能通过抑制血管内皮生长因子表达，进而抑制肾小管外周血管生成，降低血流速度；另外，高水平血管抑素可能通过引起PTC损伤，影响肾功能，从而在IgAN疾病发展中发挥作用，但具体影响机制需进一步探究证实。

本研究显示，IgAN患者尿液、血清中miR-590表达水平与血管抑素水平均呈正相关，提示miR-590与血管抑素可能相互影响，进而协同IgAN发生发展，但具体影响机制有待深入研究。本研究中尿液、血清miR-590、血管抑素对IgAN具有一定诊断价值，但诊断效能较低，尿液及血清miR-590、血管抑素联合诊断IgAN的AUC分别为0.903、0.910，对应灵敏度分别为82.4%、91.8%，特异度分别为86.2%、80.5%，提示无论是尿液还是血清miR-590、血管抑素联合诊断IgAN的价值均高于单独诊断，可更好地筛查IgAN患者。

4 结论

IgAN患者尿液、血清中miR-590表达均上调，与血管抑素有良好相关性，miR-590、血管抑素联合诊断IgAN均有较高的价值。但未对miR-590、血管抑素相互作用机制进行深入探究，有待扩大样本量进行深入探究。